Her præsenterer vi en protokol for Ca2 + imaging i neuroner og gliaceller, som gør det muligt for dissektion af Ca2 + signaler på subcellulært opløsning. Denne proces er gældende til alle celletyper, der giver udtryk for genetisk kodet Ca2 + indikatorer.
Calcium ion (Ca2 +) er en universel intracellulære messenger molekyle, der driver flere signaling veje, fører til forskellige biologiske udgange. Koordinering af to Ca2 + signalkilder — “Ca2 + tilstrømning” fra uden for cellen og “Ca2 + release” fra de intracellulære Ca2 + gemme endoplasmatiske reticulum (ER) — anses for at ligge til grund for de forskellige spatio-temporale mønstre af Ca 2 + signaler, der forårsager flere biologiske funktioner i celler. Formålet med denne protokol er at beskrive en ny Ca2 + billedbehandling metode, der muliggør overvågning af det øjeblik “Ca2 + tilstrømning” og “Ca2 + release”. OER-GCaMP6f er en genetisk kodet Ca2 + -indikator (GECI) bestående af GCaMP6f, som er målrettet til den ER ydre membran. OER-GCaMP6f kan overvåge Ca2 + release på en højere tidsmæssige opløsning end konventionelle GCaMP6f. Kombineret med plasma membran-målrettet GECIs, kan spatio-temporale Ca2 + signal mønster beskrives ved en subcellulært opløsning. De subcellulært målrettet Ca2 + indikatorer beskrevet her, principielt tilgængelig for alle celletyper, selv for in vivo billeddannelse Caenorhabditis elegans neuroner. I denne protokol, vi indfører Ca2 + imaging i celler fra cellelinjer, neuroner og gliaceller i dissocierede primære kulturer, og beskrive forberedelse af frosne bestanden af rotte kortikale neuroner.
Ca2 + signaler repræsenterer elevation af de intracellulære Ca2 + koncentration. Ca2 + er den universelle second messenger til eukaryote celler. Brug af Ca2 +, celler fungerer via diverse intracellulær signalering stier og fremkalde forskellige biologiske udgange. For eksempel i neuroner, synaptic vesikel release på den præsynaptiske terminal, genekspression i kernen, og induktion af synaptisk plasticitet på postsynapse er reguleret af særskilte Ca2 + signaler, der netop aktiverer den relevante downstream enzymer på de rigtige steder og med præcis timing1.
Specifikke spatiotemporelle mønstre af Ca2 + signaler aktivere de særlige downstream enzymer. Ca2 + -signaler er genereret af koordinering mellem to forskellige Ca2 + kilder: Ca2 + tilstrømning fra det ekstracellulære rum og Ca2 + frigivelse fra det endoplasmatiske reticulum (ER), der fungerer som en intracellulær Ca2 + butik. Meningsfuld spatiotemporelle Ca2 + signaling mønsteret til at fremkalde en bestemt cellefunktion understøttes også af nanodomains for 10 – 100 µM Ca2 + genereret i nærheden af Ca2 + -kanaler på plasma membran eller ER membran2. Vigtigere, er kilde af Ca2 + signaler en af de mest kritiske faktorer, der bestemmer den downstream biologiske output. I neuroner har Ca2 + tilstrømning og Ca2 + release modsatte virkninger på klynger af gamma – aminosmørsyre (GABA)A receptorer (GABAAR) på GABAergic synapser, som er ansvarlig for hæmning af neuronal ophidselse3. Ca2 + tilstrømning ledsages af massive neuronal excitation inducerer spredningen af synaptic GABAAR klynger, der henviser til, at vedvarende Ca2 + frigive fra Skadestuen fremmer klynger af synaptic GABAARs. Andre grupper har også rapporteret at tuning retning af vækst kegler er kritisk afhængige kilde af Ca2 + signal: Ca2 + tilstrømning inducerer frastødning, mens Ca2 + release guider tiltrækning af neuronal væksten kegle4. Fuldt ud at forstå den Ca2 + signalering veje underliggende specifikke cellulære udgange, er det derfor vigtigt at identificere kilden af Ca2 + signaler ved at beskrive Ca2 + signaler på subcellulært opløsning.
I denne protokol beskriver vi en Ca2 + billedbehandling metode for at rapportere Ca2 + signaler på subcellulært opløsning, der giver mulighed for vurdering af Ca2 + signalkilder (figur 1). Ca2 + microdomains lige under plasmamembran bliver korrekt overvåget af genetisk kodet Ca2 + indikatorer (GECIs) rettet til plasma-membran via udlæg i plasma membran-lokalisering signal Lck i Src kinase til N-termini GECIs5. For at registrere Ca2 + signal mønster i nærheden på Skadestuen med en bedre rumlige og tidsmæssige opløsning, udviklet vi for nylig OER-GCaMP6f, i hvilke GCaMP6f6 mål på Skadestuen ydre membran, ved hjælp af ER transmembrane protein. OER-GCaMP6f kan nænsomt rapport Ca2 + release fra Skadestuen på en bedre spatiotemporelle opløsning end konventionelle disse GCaMP6f i COS-7 celler7 og HEK293 celler8, ved at undgå udbredelse af Ca2 + og GECIs . Vi bekræftede også, at den spontane Ca2 + elevation i kulturperler hippocampus astrocytter rapporteret af OER-GCaMP6f viste et andet spatiotemporelle mønster i forhold til, overvåges af plasma membran-målrettet GCaMP6f (Lck-GCaMP6f)7 ,9, der angiver, at Ca2 + imaging med OER-GCaMP6f i kombination med Lck-GCaMP6f bidrager til dissektion af Ca2 + signaler på subcellulært beslutningen om at identificere deres kilder.
I øjeblikket, detalje vi protokol for Ca2 + signal dissektion i HeLa celler og neuron-astrocyte blandede kulturer belagt på glas coverslips. Ca2 + imaging teknik med GECIs angivet her, Lck-GCaMP6f, plasma-membran-målrettet RCaMP210 (Lck-RCaMP2), og OER-GCaMP6f (figur 1) er gældende for alle celler, hvor disse GECIs kan udtrykkes.
Forskellige biologiske udgange er initieret af Ca2 + signaler. Ca2 + er en alsidig intracellulær signalering messenger. Afkodning af Ca2 + signaler til at fremkalde bestemte udgange har været et grundlæggende biologiske spørgsmål, og Ca2 + Billeddannende teknikker til at beskrive mangfoldigheden af Ca2 + signaler er påkrævet. I øjeblikket detaljerede protokollen giver mulighed for påvisning af særskilte Ca2 + signaler på plasma membran og ER (figur 3 og figur 4) og lokale Ca2 + microdomains inde i en celle (figur 4 og figur 5). Dette bidrager til at beskrive mangfoldigheden af intracellulære Ca2 + signaler. Den tidsmæssige opløsning af Ca2 + -signaler var også forbedres ved at målrette GECIs i plasma membran og ER, fordi det kan undgå effekten af en tre-dimensionel diffusion af Ca2 + og GECIs sig selv, og det har potentiale til at afsløre den øjeblik af Ca2 + tilstrømning eller Ca2 + udgivelse, som opstår på membranen.
Protokollen har nogle begrænsninger. Brugernes burde holde inde indre at de fundne signaler er summen af “øjeblikket af Ca2 + tilstrømning eller release” og “Ca2 + spredt ud fra den oprindelige Ca2 + kilde”, især for store Ca2 + signaler. For eksempel, selv om hans stimulation i HeLa celler fremkalder Ca frigive2 + fra Skadestuen, dens resulterende Ca2 + -signaler registreres ikke kun ER målrettet OER-GCaMP6f, men også plasma-membran-målrettet Lck-RCaMP2 (figur 3). En anden begrænsning er, at det spatiotemporelle mønster af Ca2 + signaler ikke kan være den eneste afgørende faktor af produktionen af Ca2 + signaler. Fordelingen af downstream effektor proteiner (såsom Ca2 +-afhængige kinaser og fosfataser) kan også være en bestemmelse af faktor2. For at helt afkode de intracellulære Ca2 + signaler, er analyse af downstream enzym adfærd, som ikke er dækket i denne protokol, absolut nødvendigt.
En af de mest kritiske aspekter for vellykket Ca2 + imaging er tænkelig setup og image erhvervelse betingelser, såvel som for andre live imaging studier. Tidligere viste vi, at Ca2 + reaktioner i cellen er stærkt afhængig af varigheden og intensiteten af excitation og image erhvervelse betingelser, herunder eksponering tid og erhvervelse frekvens16. Excitation belysning magt er den mest kritiske faktor, da det kan forårsage lys toksicitet og photobleaching af GECIs. Optagelse betingelserne for eksponeringstid, optagelse frekvens, excitations lys intensitet og varighed af optagelse skal optimeres ifølge Formålet med forsøget. Vi anbefaler, at reducere eksponeringstiden og excitation lysintensitet så vidt muligt at undgå photobleaching og fototoksicitet til cellen. Optagelse hyppighed og varighed af optagelse skal være tilstrækkelig til at dække Ca2 + elevation begivenhederne af interesse, men bør holdes så lavt som muligt for at undgå photobleaching og fototoksicitet også. Vi anbefaler bestemmelse optagelse frekvens og varighed først og optimere lysintensiteten og eksponeringstiden, således at photobleaching af GECIs er minimeret. En anden vigtig faktor er det udtryk for GECIs. GECIs har en Ca2 +-Bufferkapacitet virkning, som de er Ca2 +-bindende proteiner. Derfor resulterer overekspression af GECIs i buffering af Ca2 +, som er fysiologisk nødvendige for cellerne. Mængden af GECI udtryk bør minimeres for at undgå imaging celler, der udtrykker høje mængder af GECIs.
Afslutningsvis er dissektion af Ca2 + signaler på en subcellulært opløsning en af de vigtigste skridt for at afkode intracellulære Ca2 + signaler, der bestemmer output biologisk fænomen. Denne protokol indeholder en ny metode til dissektion af Ca2 + signaler til at beskrive mangfoldighed blandt disse signaler. Denne teknik er i øjeblikket begrænset til in vitro-eksperimenter. Men Lck-GCaMP6f bruges allerede til in vivo Ca2 + imaging i mus17, og OER-GCaMP6f blev bekræftet for at overvåge Ca2 + -signaler in vivo i VD motoriske neuroner i C. elegans7. Rettet mod GECIs i subcellulært rum har derfor potentialet til at blive udvidet til in vivo billeddannelse fremover, således gør det muligt Ca2 + dissektion in vivo.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde er støttet af de følgende tilskud: Japan videnskab og teknologi agentur (JSO) / Precursory forskning i embryonale videnskab og teknologi (PRESTO) (JPMJPR15F8, Japan); Japan-samfund til fremme af videnskab (JSP’ER) / tilskud i støtte til videnskabelig forskning (KAKENHI) (JP18H05414, JP17H05710, JP16K07316), Takeda Foundation. Forfatterne takke Haruhiko Bito (University of Tokyo) for at give RCaMP2 og Arthur J.Y. Huang og Thomas McHugh (RIKEN CBS) for at give AAV vektorer og instruktioner vedrørende AAV forberedelse. Forfatterne vil også gerne takke redaktionen på tidsskriftet af visualiseret eksperimenter for deres hjælp med video filme og redigere.
(RS)-3,5-Dihydroxyphenylglycine (DHPG) | Tocris | #0342 | |
0.5% DNase I stock solution | Sigma-Aldrich | #11284932001 | Prepare 0.5% DNase I (w/v) in Hanks' Balanced Salt Solution supplemented with 120 mM MgSO4. Prepare 160 µL aliquots and store at -30°C. |
0.5% Trypsin-EDTA solution | Thermo Fisher Scientific | #25300054 | |
100 mM L-glutamine (×100 stock) | Thermo Fisher Scientific | #25030081 | Preparing small aliquots of 250–750 µL and store at -30°C. |
100 mM Sodium pyruvate (×100 stock) | Thermo Fisher Scientific | #11360070 | Aliquots (10 mL) can be stored at -20°C. After thawing, the solution can be maintained at 4°C for 2 months. |
12-Well multiwell culture plates with low-evaporation lid | Falcon | #353043 | Low-evaporation lid is critical for culturing neuron-glia mixed culture. For cell line cells, alternative culture dishes can be used. |
18-mm diameter circular coverslips | Karl Hecht "Assistent" | #41001118 | Thickness 1, 18-mm diameter circular coverslips; alternative coverslips can be used. |
1M HEPES | Thermo Fisher Scientific | #15630080 | pH 7.2 – 7.6 |
2.5% Trypsin stock solution (×20 stock) | Sigma-Aldrich | #T4674 | Prepare 150 µL aliquot and store at -30°C. |
50% Poly(ethyleneimine) (PEI) solution | Sigma-Aldrich | #P3143 | Prepare 2% (V/V) PEI stock solution (×50) with distilled water sterilized by filtration. Store stock solution at -30°C after preparing small aliquots of 250-750 µL. Prepare 0.04% PEI solution with distilled water on the day of coverslip coating. |
70% Ethanol | Kept in a spray bottle to be used for surface disinfection. | ||
Adeno-associated virus (AAV) for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under the direction of the EF1a promoter | AAV can be prepared using AAV Helper Free System (Agilent Technologies) and HEK293 cells, or alternative methods. pAAV.EF1a.Lck-GCaMP6f, pAAV.EF1a.Lck-RCaMP2, and pAAV.EF1a.OER-GCaMP6f are available upon request. | ||
B-27 supplement (×50 stock) | Thermo Fisher Scientific | #17504044 | This can be replaced by B-27 plus supplement (Thermo Fisher Scientific; #A3582801) or MACS NeuroBrew-21 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany; #130-093-566). |
B57BL/6 | Japan SLC, Inc. | ||
Camera for microscopic image recording | The following cameras were available for use: cooled-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics, OECA-ER), EM-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics, ImagEM; Andor, iXon) or CMOS camera (e.g., Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0) | ||
Cell freezing container | Sarstedt K.K. | #95.64.253 | Alternative cell freezing container can be used. |
Cell strainer | Falcon | #352350 | |
CO2 incubator | Maintain at 37°C, 5% CO2. | ||
Cryogenic tube | Corning | #430661 | Alternative cryogenic tubes can be used. |
Cryopreservation medium | Zenoaq | "CELLBANKER1" | |
Culture medium (for HeLa cells) | Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum, and penicillin-streptomycin solution (final concentration: Penicillin 100 units/mL and Streptomycin 100 µg/mL) | ||
Dissection medium | One milliliter of 1 M HEPES (final concentration 20 mM) to 49 mL DMEM | ||
DMEM | Nacalai | #08456-65 | Alternative DMEM can be used. |
DMEM | Nacalai | #08456-65 | Low glucose |
DNA transfection reagent | Sigma-Aldrich | #6366244001 | "X-tremegene HP DNA transfection reagent" Alternative transfection reagents can be used. |
Glass jar with a lid | 500 mL jar (for mouse) or 1500 mL jar (for rat) to anesthetize the animal | ||
HBSS | Thermo Fisher Scientific | #14170161 | HBSS free of calcium and magnesium |
Heat inactivated bovine serum | Thermo Fisher Scientific | #10100147 | |
HeLa cells | RIKEN BioResource Center | #RCB0007 | |
Histamine | Sigma-Aldrich | #H7125 | |
Image analysis software | Such as Metamorph (Molecular Devices), Image J (NIH), and TI Workbench14 (custom made) | ||
Image splitting optics | Hamamatsu Photonics | #A12801-01 | W-view GEMINI |
Image splitting optics dichroic mirror | Semrock | #FF560-FDi01-25×36 | For separation of green fluorescent protein/red fluorescent protein (GFP/RFP) signal |
Image splitting optics emission filters | Semrock | #FF01-512/25-25, #FF01-630/92-25 | For emission of GFP/RFP signal, respectively |
Imaging medium and buffer | Use optimal medium or buffer for the experiment. When medium is used, medium without phenol red is desirable to reduce background fluorescence. Add 20 mM HEPES to maintain pH outside of CO2 incubator. | ||
Incubation saline | Add 1 mL of 1 M HEPES (20 mM) to 49 mL HBSS | ||
Inverted fluorescence microscope | Such as IX73 (Olympus) or Eclipse TI (Nikon Instech) | ||
Isoflurane | Pfizer | Used for anesthesia | |
Maintenance medium (for 4 × 12 well dishes) | 48.5 mL Neurobasal-A medium supplemented with 1 mL B-27, 500 µL of L-glutamine stock and 25 µL Penicillin-Streptomycin solution. | ||
Maintenance medium for frozen cortical cells (for 1 × 12 well dishes) | 12.2 mL Neurobasal plus medium supplemented with 250 µL B-27, 125 µL of L-glutamine stock and 6.2 µL Penicillin-Streptomycin solution. | ||
MEM (Minimum Essential Medium) | Thermo Fisher Scientific | #11090-081 | |
Microscope filter set for GCaMP6f imaging | Appropriate filter for GFP (excitation, 480 ± 10 nm; emission, 530 ± 20 nm) | ||
Microscope filter set for RCaMP2 imaging | Appropriate filter for RFP (excitation, 535 ± 50 nm; emission, 590 nm long pass) | ||
Microscope filter sets for double imaging of RCaMP2 and GCaMP6f | Semrock | #FF01-468/553-25, #FF493/574-FDi01-25×36, #FF01-512/630-25 | Dual excitation filter, Dual dichroic mirror, and emission filter for GFP/RFP imaging. |
Microscope heating system | A heating system to maintain cells at 37°C during the imaging. To avoid drift caused by thermal expansion, heating systems covering the entire microscope itself (e.g., Tokai Hit, Thermobox) are recommended. | ||
Microscope light source for excitation | Mercury lamp (100 W), xenon lamp (75 W), Light-emitting diode (LED) illumination system (e.g., CoolLED Ltd., precisExcite; Thorlabs Inc., 4-Wavelength LED Source; Lumencor, SPECTRA X light engine). In case of mercury lump and xenon lamp, use ND filter to reduce the excitation intensity. | ||
Microscope objective lens | Plan-Apochromat oil immersion objective with numerical aperture higher than 1.3 is highly recommended for the recording of spontaneous Ca2+ activity in neurons and astrocytes. | ||
Neurobasal plus medium | Thermo Fisher Scientific | #A3582901 | |
Neurobasal-A Medium | Thermo Fisher Scientific | #10888022 | Neurobasal plus medium (Thermo Fisher, A3582901) can be used instead of Neurobasal-A medium. |
PBS(-): Phosphate-buffered saline free of Ca2+ and Mg2+ | Fujifilm Wako Pure Chemical Cooperation | #164-23551 | The absence of Ca2+ and Mg2+ is critical not to inhibit the trypsin activity. An alternative to PBS(-) can be used. |
PC and image acquisition software | Such as Metamorph (Molecular Devices); Micromanager; TI Workbench14. | ||
Penicillin-Streptomycin solution | Thermo Fisher Scientific | #15140122 | Penicillin 10,000 units/mL and Streptomycin 10,000 µg/mL |
Plasmid for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under cytomegalovirus promoter 7-9 | Available upon request | ||
Plating medium (for 4 × 12 well dishes) | 48 mL MEM supplemented with 1 mL B-27 supplement, 500 µL L-glutamine stock (final concentration: 2 mM), 500 µL of sodium pyruvate stock (1 mM) and 25 µL Penicillin-Streptomycin solution (penicillin 5 u/mL, streptomycin 5 µg/mL). This concentration of Penicillin-Streptomycin, which is 1/20 of the concentration recommended by the manufacturer, is critical for neuronal survival. | ||
Recording chamber | Elveflow | Ludin Chamber | This recording chamber is for 18 mm diameter round coverslips. |
Reduced serum media | Thermo Fisher | #11058021 | Opti-MEM |
Stereomicroscope | Used to dissect hippocampi. Olympus SZ60 or equivalent stereomicroscopes are available. | ||
Surgical instruments | Standard dissecting scissors to cut the abdomen of a mouse or a rat, tweezers to pinch the uterus, delicate dissecting scissors to cut the uterus and the head of embryo, ring forceps to pinch the embryos, 13-cm curved Semken forceps (Fine Science Tools #11009-13) to extract brains, 3 forceps with fine tips (Dumont Inox #5) | ||
Transfection reagent for neuron | Thermo Fisher Scientific | #L3000008 | "Lipofectamine 3000" reagent. It is composed of the the "supplement (P3000)" that should be mixed with plasmid DNA in the step 2.2.3, and the "transfection reagent (lipofectamine 3000)" used in the step 2.2.4. |
Trypan blue (0.4%) | Thermo Fisher Scientific | #15250061 | |
Wash medium for frozen cortical cells | 25 mL DMEM, supplemented with 250 µL heat-inactivated fetal bovine serum + 12.5 µL Penicillin Streptomycin. | ||
Wistar rats | Japan SLC, Inc | Pregnant rats (E18) |