यहां हम Ca के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत2 + ंयूरॉंस और glial कोशिकाओं में इमेजिंग, जो ca 2 के विच्छेदन सक्षम बनाता है+ subcellular संकल्प में सिग्नल । यह प्रक्रिया सभी कक्ष प्रकारों पर लागू होती है जो आनुवंशिक रूप से एंकोडेड Ca2 + संकेतकों की अभिव्यक्ति की अनुमति देते हैं ।
कैल्शियम आयन (Ca2 +) एक सार्वभौमिक intracellular दूत अणु है कि कई संकेत मार्ग ड्राइव, विविध जैविक outputs के लिए अग्रणी है । दो ca के समंवय2 + सिग्नल स्रोतों-“ca2 + आमद” सेल के बाहर से और “ca2 + रिलीज” intracellular Ca2 से + स्टोर अंतर्द्रव्यी रेटिलियम (ईआर)-के लिए विविध spatio-लौकिक पैटर्न के लिए माना जाता है ca 2 + संकेतों कि कोशिकाओं में कई जैविक कार्यों का कारण । इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य एक नया Ca2 + इमेजिंग विधि का वर्णन करने के लिए है जो “ca 2 + आमद” और “ca2 + release” के परिक्षण की निगरानी को सक्षम करता है । OER-GCaMP6f एक आनुवंशिक रूप से एनकोडेड Ca2 + संकेतक (geci) GCaMP6f शामिल है, जो ईआर बाहरी झिल्ली को लक्षित है । OER-GCaMP6f सीए 2 की निगरानी कर सकते हैं+ पारंपरिक GCaMP6f की तुलना में एक उच्च लौकिक संकल्प पर रिहाई. प्लाज्मा झिल्ली-लक्षित GECIs के साथ संयुक्त, spatio-लौकिक सीए2 + सिग्नल पैटर्न एक subcellular संकल्प में वर्णित किया जा सकता है । subcellular लक्षित सीए2 + संकेतक यहां वर्णित हैं, सिद्धांत रूप में, सभी प्रकार के सेल के लिए उपलब्ध है, यहां तक कि vivo इमेजिंग में caenorहैबडाइटिस एलिगेंस ंयूरॉंस के लिए । इस प्रोटोकॉल में, हम सेल लाइनों, ंयूरॉंस से कोशिकाओं में सीए2 + इमेजिंग परिचय, और वियोजित प्राथमिक संस्कृतियों में glial कोशिकाओं, और चूहे वल्कुट ंयूरॉंस के जमे हुए शेयर की तैयारी का वर्णन ।
Ca2 + सिग्नल intracellular ca2 + एकाग्रता की ऊंचाई का प्रतिनिधित्व करते हैं । Ca2 + यूकार्योटिक कोशिकाओं के लिए सार्वभौमिक दूसरा दूत है । Ca का उपयोग कर2 +, कोशिकाओं विविध intracellular संकेत मार्ग के माध्यम से कार्य और विभिन्न जैविक outputs प्रेरित. उदाहरण के लिए, ंयूरॉंस, presynaptic टर्मिनल, नाभिक में जीन अभिव्यक्ति में synaptic आशय जारी, और postsynapse में synaptic सुघट्यता के प्रेरण विशिष्ट Ca 2 द्वारा विनियमित रहे हैं+ संकेत है कि ठीक से उपयुक्त सक्रिय सही साइटों पर डाउनस्ट्रीम एंजाइमों और सटीक समय के साथ1।
विशिष्ट अनुप्रवाह एंजाइमों को सक्रिय Ca2 + संकेतों के विशेष spatioलौकिक पैटर्न । ca 2 + सिग्नल दो अलग ca2 + स्रोतों के बीच समंवय द्वारा उत्पंन होते हैं: ca2 + अंतर्द्रव्यी रेटिक्युलम (ईआर), जो एक intracellular ca 2 + के रूप में कार्य करता है, से extracellular अंतरिक्ष और ca2 + रिलीज से आमद स्टोर । एक विशिष्ट सेल समारोह को प्रेरित करने के लिए सार्थक spatioलौकिक सीए2 + सिग्नलिंग पैटर्न भी प्लाज्मा झिल्ली या ईआर झिल्ली2पर सीए2 + चैनलों के आसपास में उत्पन्न 10-100 μm सीए2 के nanodomains द्वारा समर्थित है । महत्वपूर्ण बात, Ca के स्रोत2 + संकेत सबसे महत्वपूर्ण बहाव जैविक उत्पादन का निर्धारण कारकों में से एक है । न्यूरॉन्स में, ca2 + तांता और ca2 + रिहाई गैबेराइजिक synapses, जो की निषेध के लिए जिंमेदार है पर गामा aminobutyric एसिड (गाबा)एक रिसेप्टर्स (गाबाएआर) के क्लस्टरिंग पर विपरीत प्रभाव है न्यूरोनल excitability3. ca2 + बड़े पैमाने पर न्यूरोनल उत्तेजना के साथ तांता synaptic गाबाएआर क्लस्टर्स के फैलाव लाती, जबकि लगातार Ca2 + ईआर से रिहाई synaptic गाबाएकरुपये के क्लस्टरिंग को बढ़ावा देता है. अंय समूहों ने यह भी बताया है कि विकास शंकु की ट्यूनिंग दिशा गंभीर रूप से ca के स्रोत पर निर्भर है2 + सिग्नल: ca 2 + आमद लाती प्रतिकर्षण, जबकि ca2 + रिलीज गाइड न्यूरोनल विकास के आकर्षण कोन४. इसलिए, पूरी तरह से सीए 2 को समझने के लिए+ विशिष्ट सेलुलर outputs अंतर्निहित मार्ग सिग्नलिंग, यह ca 2 + संकेतों के स्रोत की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है Subcellular संकल्प में ca के दो+ संकेतों का वर्णन ।
इस प्रोटोकॉल में, हम ca 2 + इमेजिंग विधि की रिपोर्ट करने के लिए ca 2 + संकेतों subcellular रिज़ॉल्यूशन पर, जो सीए2 + संकेत स्रोतों का अनुमान (चित्रा 1) की अनुमति देता है का वर्णन । Ca2 + प्लाज्मा झिल्ली के नीचे सिर्फ microdomains सफलतापूर्वक आनुवंशिक रूप से एनकोडेड Ca2 + संकेतक (gecis) प्लाज्मा झिल्ली के लगाव के माध्यम से प्लाज्मा झिल्ली को लक्षित द्वारा निगरानी कर रहे हैं-स्थानीयकरण सिग्नल Lck के भीतर एसआरसी कीनेस को एन-टर्मी ऑफ गेकिस5. एक बेहतर स्थानिक और लौकिक संकल्प पर ईआर के आसपास में Ca2 + संकेत पैटर्न का पता लगाने के लिए, हम हाल ही में oer-GCaMP6f, जिसमें GCaMP6f6 ईआर बाहरी झिल्ली लक्ष्य, ईआर transmembrane प्रोटीन का उपयोग कर विकसित की है । OER-GCaMP6f संवेदनशीलता सीए 2+ जारी करने के लिए एक बेहतर spatioलौकिक संकल्प पर एर से COS में पारंपरिक Nontargeted GCaMP6f की तुलना कर सकते हैं-7 कोशिकाओं7 और HEK293 कोशिकाओं8, ca के प्रसार से बचने के द्वारा2 + और gecis . हम यह भी पुष्टि की है कि सहज Ca2 + सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पल astrocytes में ऊंचाई oer द्वारा रिपोर्ट-GCaMP6f प्लाज्मा झिल्ली द्वारा निगरानी की तुलना में एक अलग स्पैटिओटेंटल पैटर्न दिखाया-लक्षित GCaMP6f (Lck-GCaMP6f)7 ,9, का संकेत है कि ca2 + oer के साथ इमेजिंग-lck के साथ संयोजन में GCaMP6f-GCaMP6f ca के विच्छेदन के लिए योगदान देता है+ subcellular संकल्प में संकेतों को अपने स्रोतों की पहचान ।
वर्तमान में, हम विस्तार से Ca के लिए प्रोटोकॉल2 + हेला कोशिकाओं में सिग्नल विच्छेदन और neuron-astrocyte मिश्रित संस्कृति कांच coverslips पर चढ़ाया । Ca2 + gecis के साथ इमेजिंग तकनीक यहां संकेत दिया, Lck-GCaMP6f, प्लाज्मा-झिल्ली-लक्षित RCaMP210 (lck-RCAMP2), और Oer-GCaMP6f (चित्रा 1) सभी कोशिकाओं में इन gecis व्यक्त किया जा सकता है लागू होते हैं ।
विविध जैविक outputs सीए2 + संकेतों द्वारा शुरू कर रहे हैं । Ca2 + एक बहुमुखी intracellular संकेतन दूत है । Ca 2+ संकेतों के लिए विशिष्ट outputs आह्वान एक मौलिक जैविक सवाल किया गया है, और ca 2+ इमेजिंग तकनीकों ca2 की विविधता का वर्णन करने के लिए + संकेतों की आवश्यकता है । वर्तमान में विस्तृत प्रोटोकॉल प्लाज्मा झिल्ली और ईआर पर अलग Ca2 + संकेतों का पता लगाने में सक्षम बनाता है (चित्रा3 और चित्रा 4) और एक सेल के अंदर स्थानीय सीए2 + microdomains (चित्रा 4 और चित्रा 5). यह intracellular Ca2 + संकेतों की विविधता का वर्णन करने के लिए योगदान देता है । सीए2 + संकेतों के लौकिक संकल्प भी प्लाज्मा झिल्ली और ईआर में gecis को लक्षित करने के द्वारा सुधार किया गया था क्योंकि यह ca के तीन आयामी प्रसार के प्रभाव से बचने कर सकते हैं2 + और स्वयं gecis, और यह पता लगाने की क्षमता है बहुत Ca के पल2 + तांता या ca2 + रिहाई, जो झिल्ली पर होता है ।
प्रोटोकॉल की कुछ सीमाएं हैं । उपयोगकर्ताओं को ध्यान में रखना चाहिए कि पता लगाया संकेतों का संकलन है “ca के पल2 + आमद या रिहाई” और “ca2 + मूल ca 2 से बाहर विसरित + स्रोत “, विशेष रूप से बड़े ca के लिए2 + संकेतों. उदाहरण के लिए, हालांकि HeLa कोशिकाओं में उसकी उत्तेजना ईआर से Ca2 + रिहाई, इसके परिणामी Ca2 + सिग्नल न केवल ईआर द्वारा लक्षित oer-GCaMP6f लेकिन यह भी प्लाज्मा-झिल्ली द्वारा लक्षित lck-RCaMP2 (चित्रा 3) का पता लगाया है । एक और सीमा है कि Ca के spatioलौकिक पैटर्न2 + संकेतों के उत्पादन का केवल निर्धारक नहीं हो सकता है ca2 + संकेतों. डाउनस्ट्रीम इफेक्टर प्रोटीन्स (जैसे सीए2 +-आश्रित किनसेस और फॉस्फेट) का वितरण भी एक निर्धारक कारक2हो सकता है । पूरी तरह से intracellular Ca2 + संकेतों को समझाना, बहाव एंजाइम व्यवहार का विश्लेषण, जो इस प्रोटोकॉल में शामिल नहीं है, बिल्कुल आवश्यक है ।
सफल Ca 2 के लिए सबसे महत्वपूर्ण पहलुओं में से एक+ इमेजिंग इमेजिंग सेटअप और छवि अधिग्रहण की स्थिति है, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अंय लाइव इमेजिंग अध्ययन के लिए । हम पहले से पता चला है कि सीए2 + सेल में प्रतिक्रियाएं अत्यधिक उत्तेजना की अवधि और तीव्रता और छवि अधिग्रहण की स्थिति पर निर्भर कर रहे हैं, जोखिम समय और अधिग्रहण आवृत्ति16सहित । उत्तेजन प्रदीप्ति शक्ति सबसे महत्वपूर्ण कारक है, क्योंकि यह प्रकाश विषाक्तता और GECIs के photoब्लीचिंग पैदा कर सकता है । एक्सपोज़र समय, रिकॉर्डिंग आवृत्ति, उत्तेजन प्रकाश तीव्रता, और रिकॉर्डिंग की अवधि की रिकॉर्डिंग शर्तों प्रयोग के उद्देश्य के अनुसार अनुकूलित किया जाना चाहिए । हम सेल के लिए photoब्लीचिंग और photobleaching से बचने के लिए संभव के रूप में ज्यादा के रूप में जोखिम समय और उत्तेजना प्रकाश तीव्रता को कम करने की सलाह देते हैं । रिकॉर्डिंग आवृत्ति और रिकॉर्डिंग की अवधि सीए2 + ब्याज की तरक्की की घटनाओं को कवर करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए, लेकिन photoब्लीचिंग और photobleaching से बचने के लिए भी संभव के रूप में कम रखा जाना चाहिए. हम रिकॉर्डिंग आवृत्ति और पहले अवधि को निर्धारित करने और प्रकाश तीव्रता और जोखिम समय का अनुकूलन ताकि GECIs के photoब्लीडिंग कम है की सिफारिश । एक अंय महत्वपूर्ण कारक GECIs के अभिव्यक्ति स्तर है । GECIs एक Ca2 +-buffering प्रभाव के रूप में वे सीए2 +-बाध्यकारी प्रोटीन हैं । इसलिए, overexpression का gecis परिणाम में बफ़रिंग Ca2 +, जो भौतिक रूप से कक्षों के लिए आवश्यक है । GECIs की उच्च मात्रा व्यक्त इमेजिंग कोशिकाओं से बचने के लिए की मात्रा को कम किया जाना चाहिए ।
अंत में, Ca के विच्छेदन 2 एक subcellular संकल्प पर सिग्नल+ intracellular Ca2 + संकेत है कि उत्पादन जैविक घटना का निर्धारण करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक है । इस प्रोटोकॉल को इन संकेतों के बीच विविधता का वर्णन करने के लिए Ca2 + संकेतों के विच्छेदन के लिए एक नई विधि प्रदान करता है । वर्तमान में, यह तकनीक इन विट्रो प्रयोगों के लिए सीमित है । हालांकि, Lck-GCaMP6f पहले से ही में vivo Ca2 + 17चूहों में इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है, और oer-GCaMP6f सीमें वीवी मोटर ंयूरॉंस में vivo में ca2 + संकेतों पर नजर रखने की पुष्टि की थी 7 । इसलिए, subcellular डिब्बे में GECIs को लक्षित करने के लिए भविष्य में vivo इमेजिंग में विस्तार किया जा करने की क्षमता है, इस प्रकार सीए2 + विच्छेदन को सक्षम करने में vivo ।
The authors have nothing to disclose.
यह काम निम्नलिखित अनुदानों द्वारा समर्थित है: जापान विज्ञान और प्रौद्योगिकी एजेंसी (JST)/भ्रूण विज्ञान और प्रौद्योगिकी के लिए प्रीसरी रिसर्च (PRESTO) (JPMJPR15F8, जापान); विज्ञान के संवर्धन के लिए जापान सोसायटी (JSPS)/सहायता में वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए अनुदान (KAKENHI) (JP18H05414, JP17H05710, JP16K07316), टाकेडा फाउंडेशन । लेखकों ने AAV वैक्टर प्रदान करने के लिए और AAV तैयारी के बारे में निर्देशों के लिए RCaMP2 और आर्थर J.Y. हुआंग और थॉमस McHugh (RIKEN सीबीएस) प्रदान करने के लिए हर्हिको बिटो (टोक्यो विश्वविद्यालय) धंयवाद । लेखक भी वीडियो फिल्माने और संपादन के साथ उनकी मदद के लिए Visualized प्रयोगों के जर्नल में संपादकों का शुक्रिया अदा करना होगा ।
(RS)-3,5-Dihydroxyphenylglycine (DHPG) | Tocris | #0342 | |
0.5% DNase I stock solution | Sigma-Aldrich | #11284932001 | Prepare 0.5% DNase I (w/v) in Hanks' Balanced Salt Solution supplemented with 120 mM MgSO4. Prepare 160 µL aliquots and store at -30°C. |
0.5% Trypsin-EDTA solution | Thermo Fisher Scientific | #25300054 | |
100 mM L-glutamine (×100 stock) | Thermo Fisher Scientific | #25030081 | Preparing small aliquots of 250–750 µL and store at -30°C. |
100 mM Sodium pyruvate (×100 stock) | Thermo Fisher Scientific | #11360070 | Aliquots (10 mL) can be stored at -20°C. After thawing, the solution can be maintained at 4°C for 2 months. |
12-Well multiwell culture plates with low-evaporation lid | Falcon | #353043 | Low-evaporation lid is critical for culturing neuron-glia mixed culture. For cell line cells, alternative culture dishes can be used. |
18-mm diameter circular coverslips | Karl Hecht "Assistent" | #41001118 | Thickness 1, 18-mm diameter circular coverslips; alternative coverslips can be used. |
1M HEPES | Thermo Fisher Scientific | #15630080 | pH 7.2 – 7.6 |
2.5% Trypsin stock solution (×20 stock) | Sigma-Aldrich | #T4674 | Prepare 150 µL aliquot and store at -30°C. |
50% Poly(ethyleneimine) (PEI) solution | Sigma-Aldrich | #P3143 | Prepare 2% (V/V) PEI stock solution (×50) with distilled water sterilized by filtration. Store stock solution at -30°C after preparing small aliquots of 250-750 µL. Prepare 0.04% PEI solution with distilled water on the day of coverslip coating. |
70% Ethanol | Kept in a spray bottle to be used for surface disinfection. | ||
Adeno-associated virus (AAV) for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under the direction of the EF1a promoter | AAV can be prepared using AAV Helper Free System (Agilent Technologies) and HEK293 cells, or alternative methods. pAAV.EF1a.Lck-GCaMP6f, pAAV.EF1a.Lck-RCaMP2, and pAAV.EF1a.OER-GCaMP6f are available upon request. | ||
B-27 supplement (×50 stock) | Thermo Fisher Scientific | #17504044 | This can be replaced by B-27 plus supplement (Thermo Fisher Scientific; #A3582801) or MACS NeuroBrew-21 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany; #130-093-566). |
B57BL/6 | Japan SLC, Inc. | ||
Camera for microscopic image recording | The following cameras were available for use: cooled-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics, OECA-ER), EM-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics, ImagEM; Andor, iXon) or CMOS camera (e.g., Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0) | ||
Cell freezing container | Sarstedt K.K. | #95.64.253 | Alternative cell freezing container can be used. |
Cell strainer | Falcon | #352350 | |
CO2 incubator | Maintain at 37°C, 5% CO2. | ||
Cryogenic tube | Corning | #430661 | Alternative cryogenic tubes can be used. |
Cryopreservation medium | Zenoaq | "CELLBANKER1" | |
Culture medium (for HeLa cells) | Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum, and penicillin-streptomycin solution (final concentration: Penicillin 100 units/mL and Streptomycin 100 µg/mL) | ||
Dissection medium | One milliliter of 1 M HEPES (final concentration 20 mM) to 49 mL DMEM | ||
DMEM | Nacalai | #08456-65 | Alternative DMEM can be used. |
DMEM | Nacalai | #08456-65 | Low glucose |
DNA transfection reagent | Sigma-Aldrich | #6366244001 | "X-tremegene HP DNA transfection reagent" Alternative transfection reagents can be used. |
Glass jar with a lid | 500 mL jar (for mouse) or 1500 mL jar (for rat) to anesthetize the animal | ||
HBSS | Thermo Fisher Scientific | #14170161 | HBSS free of calcium and magnesium |
Heat inactivated bovine serum | Thermo Fisher Scientific | #10100147 | |
HeLa cells | RIKEN BioResource Center | #RCB0007 | |
Histamine | Sigma-Aldrich | #H7125 | |
Image analysis software | Such as Metamorph (Molecular Devices), Image J (NIH), and TI Workbench14 (custom made) | ||
Image splitting optics | Hamamatsu Photonics | #A12801-01 | W-view GEMINI |
Image splitting optics dichroic mirror | Semrock | #FF560-FDi01-25×36 | For separation of green fluorescent protein/red fluorescent protein (GFP/RFP) signal |
Image splitting optics emission filters | Semrock | #FF01-512/25-25, #FF01-630/92-25 | For emission of GFP/RFP signal, respectively |
Imaging medium and buffer | Use optimal medium or buffer for the experiment. When medium is used, medium without phenol red is desirable to reduce background fluorescence. Add 20 mM HEPES to maintain pH outside of CO2 incubator. | ||
Incubation saline | Add 1 mL of 1 M HEPES (20 mM) to 49 mL HBSS | ||
Inverted fluorescence microscope | Such as IX73 (Olympus) or Eclipse TI (Nikon Instech) | ||
Isoflurane | Pfizer | Used for anesthesia | |
Maintenance medium (for 4 × 12 well dishes) | 48.5 mL Neurobasal-A medium supplemented with 1 mL B-27, 500 µL of L-glutamine stock and 25 µL Penicillin-Streptomycin solution. | ||
Maintenance medium for frozen cortical cells (for 1 × 12 well dishes) | 12.2 mL Neurobasal plus medium supplemented with 250 µL B-27, 125 µL of L-glutamine stock and 6.2 µL Penicillin-Streptomycin solution. | ||
MEM (Minimum Essential Medium) | Thermo Fisher Scientific | #11090-081 | |
Microscope filter set for GCaMP6f imaging | Appropriate filter for GFP (excitation, 480 ± 10 nm; emission, 530 ± 20 nm) | ||
Microscope filter set for RCaMP2 imaging | Appropriate filter for RFP (excitation, 535 ± 50 nm; emission, 590 nm long pass) | ||
Microscope filter sets for double imaging of RCaMP2 and GCaMP6f | Semrock | #FF01-468/553-25, #FF493/574-FDi01-25×36, #FF01-512/630-25 | Dual excitation filter, Dual dichroic mirror, and emission filter for GFP/RFP imaging. |
Microscope heating system | A heating system to maintain cells at 37°C during the imaging. To avoid drift caused by thermal expansion, heating systems covering the entire microscope itself (e.g., Tokai Hit, Thermobox) are recommended. | ||
Microscope light source for excitation | Mercury lamp (100 W), xenon lamp (75 W), Light-emitting diode (LED) illumination system (e.g., CoolLED Ltd., precisExcite; Thorlabs Inc., 4-Wavelength LED Source; Lumencor, SPECTRA X light engine). In case of mercury lump and xenon lamp, use ND filter to reduce the excitation intensity. | ||
Microscope objective lens | Plan-Apochromat oil immersion objective with numerical aperture higher than 1.3 is highly recommended for the recording of spontaneous Ca2+ activity in neurons and astrocytes. | ||
Neurobasal plus medium | Thermo Fisher Scientific | #A3582901 | |
Neurobasal-A Medium | Thermo Fisher Scientific | #10888022 | Neurobasal plus medium (Thermo Fisher, A3582901) can be used instead of Neurobasal-A medium. |
PBS(-): Phosphate-buffered saline free of Ca2+ and Mg2+ | Fujifilm Wako Pure Chemical Cooperation | #164-23551 | The absence of Ca2+ and Mg2+ is critical not to inhibit the trypsin activity. An alternative to PBS(-) can be used. |
PC and image acquisition software | Such as Metamorph (Molecular Devices); Micromanager; TI Workbench14. | ||
Penicillin-Streptomycin solution | Thermo Fisher Scientific | #15140122 | Penicillin 10,000 units/mL and Streptomycin 10,000 µg/mL |
Plasmid for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under cytomegalovirus promoter 7-9 | Available upon request | ||
Plating medium (for 4 × 12 well dishes) | 48 mL MEM supplemented with 1 mL B-27 supplement, 500 µL L-glutamine stock (final concentration: 2 mM), 500 µL of sodium pyruvate stock (1 mM) and 25 µL Penicillin-Streptomycin solution (penicillin 5 u/mL, streptomycin 5 µg/mL). This concentration of Penicillin-Streptomycin, which is 1/20 of the concentration recommended by the manufacturer, is critical for neuronal survival. | ||
Recording chamber | Elveflow | Ludin Chamber | This recording chamber is for 18 mm diameter round coverslips. |
Reduced serum media | Thermo Fisher | #11058021 | Opti-MEM |
Stereomicroscope | Used to dissect hippocampi. Olympus SZ60 or equivalent stereomicroscopes are available. | ||
Surgical instruments | Standard dissecting scissors to cut the abdomen of a mouse or a rat, tweezers to pinch the uterus, delicate dissecting scissors to cut the uterus and the head of embryo, ring forceps to pinch the embryos, 13-cm curved Semken forceps (Fine Science Tools #11009-13) to extract brains, 3 forceps with fine tips (Dumont Inox #5) | ||
Transfection reagent for neuron | Thermo Fisher Scientific | #L3000008 | "Lipofectamine 3000" reagent. It is composed of the the "supplement (P3000)" that should be mixed with plasmid DNA in the step 2.2.3, and the "transfection reagent (lipofectamine 3000)" used in the step 2.2.4. |
Trypan blue (0.4%) | Thermo Fisher Scientific | #15250061 | |
Wash medium for frozen cortical cells | 25 mL DMEM, supplemented with 250 µL heat-inactivated fetal bovine serum + 12.5 µL Penicillin Streptomycin. | ||
Wistar rats | Japan SLC, Inc | Pregnant rats (E18) |