Her presenterer vi en protokoll for Ca2 + imaging i neurons og gliacellene, som gjør Disseksjon av Ca2 + signaler på subcellular oppløsning. Denne prosessen gjelder alle celletyper at uttrykket av genetisk kodet Ca2 + indikatorer.
Kalsium ion (Ca2 +) er en universell intracellulær messenger molekyl som driver flere signalveier, fører til ulike biologiske utganger. Samordning av to Ca2 + signalkilder-“Ca2 + tilstrømningen” fra utenfor cellen og “Ca2 + release” fra den intracellulær Ca2 + lagre endoplasmatiske retikulum (ER)-regnes som ligger til grunn for mangfoldig spatio-temporale mønstre av Ca 2 + signaliserer at flere biologiske funksjoner i cellene. Formålet med denne protokollen er å beskrive en ny Ca2 + bildebehandling metode som aktiverer overvåking av øyeblikket av “Ca2 + tilstrømningen” og “Ca2 + release”. OER-GCaMP6f er en genetisk kodet Ca2 + indikator (GECI) består av GCaMP6f, som er rettet mot den ER ytre membranen. OER-GCaMP6f kan overvåke Ca2 + utgivelsen høyere timelige oppløsning enn konvensjonelle GCaMP6f. Kombinert med plasma membran-målrettet GECIs, kan spatio-temporale Ca2 + signal mønsteret beskrives subcellular oppløsning. Subcellular-målrettet Ca2 + indikatorene beskrevet her er, i prinsippet, tilgjengelig for alle celletyper, selv for i vivo bildebehandling av Caenorhabditis elegans neurons. I denne protokollen, vi introdusere Ca2 + imaging i celler fra cellelinjer, nerveceller og gliacellene i dissosiert primære kulturer og beskrive utarbeidelse av frosne lager av rotte kortikale nevroner.
Ca2 + signaler representerer høyden av intracellulær Ca2 + konsentrasjonen. Ca2 + er universell andre messenger for eukaryote celler. Bruker Ca2 +, celler funksjon via ulike intracellulær signalveier og indusere biologiske resultatdata. For eksempel i neurons, synaptic vesicle utgivelsen på presynaptic terminalen, genuttrykk i kjernen og induksjon av synaptiske plastisitet på postsynapse er regulert av forskjellige Ca2 + signaler som nettopp aktiverer riktig nedstrøms enzymer i riktig steder og med nøyaktige tidspunktet1.
Bestemt spatiotemporal mønstre av Ca2 + signaler aktivere bestemte nedstrøms enzymer. Ca2 + signaler genereres av koordinering mellom to ulike Ca2 + kilder: Ca2 + tilstrømningen ekstracellulære romslighet og Ca2 + utgivelse fra det endoplasmatiske retikulum (ER), som fungerer som en intracellulær Ca2 + lagre. Meningsfull spatiotemporal Ca2 + signalnettverk mønsteret å indusere en bestemt celle funksjon støttes også av nanodomains av 10-100 µM Ca2 + generert i Ca2 + kanaler på plasma membran eller ER membran2. Viktigere, er kilden av Ca2 + signaler en av de viktigste faktorene fastsettelse nedstrøms biologiske utdataene. I neurons har Ca2 + tilstrømningen og Ca2 + utgivelsen motsatt effekt på klynger av gamma – aminobutyric acid (GABA)A reseptorer (GABAAR) på GABAergic synapser, som er ansvarlig for hemming av neuronal excitability3. Ca2 + tilstrømningen ledsaget av massiv neuronal eksitasjon induserer spredning av synaptic GABAAR klynger, mens vedvarende Ca2 + slipp fra ER fremmer klynger av synaptic GABAARs. Andre grupper har også rapportert at tuning retning av veksten kjeglene er kritisk avhengig av kilden av Ca2 + : Ca2 + tilstrømningen induserer repulsjon, mens Ca2 + utgivelsen styrer tiltrekningen av den dannes hemmer nevronal veksten kjegle4. Derfor, å fullt ut forstå den Ca2 + signalnettverk trasé underliggende bestemt mobilnettet utganger, er det viktig å identifisere kilden til Ca2 + signaler ved å beskrive Ca2 + signaler på subcellular oppløsning.
I denne protokollen beskriver vi en Ca2 + bildebehandling metode for å rapportere Ca2 + signaler på subcellular oppløsning, som lar estimering av Ca2 + signalkildene (figur 1). Ca2 + microdomains like under plasma membranen overvåkes vellykket av genetisk kodet Ca2 + indikatorer (GECIs) rettet mot plasma membranen via feste plasma membran-lokalisering signalet Lck i Src kinase til N-jernbanestasjonen termini GECIs5. For å oppdage Ca2 + signal mønsteret i ER bedre romlige og tidsmessige oppløsning, utviklet vi nylig OER-GCaMP6f, i som GCaMP6f6 mål ER ytre membran, bruker ER transmembrane protein. OER-GCaMP6f kan sensitively rapportere Ca2 + utgivelse fra ER bedre spatiotemporal oppløsning enn konvensjonelle nontargeted GCaMP6f COS-7 celler7 og HEK293 celler8, ved å unngå spredningen av Ca2 + og GECIs . Vi også bekreftet at den spontane Ca2 + høyden i kulturperler hippocampus astrocyttene rapportert av OER-GCaMP6f viste et annet spatiotemporal mønster forhold som overvåkes av plasma membranen målrettede GCaMP6f (Lck-GCaMP6f)7 ,9, som indikerer at Ca2 + bildebehandling med OER-GCaMP6f i kombinasjon med Lck-GCaMP6f bidrar til Disseksjon av Ca2 + signaler på subcellular oppløsningen å identifisere sine kilder.
For tiden detalj vi protokollen for Ca2 + signal dissection HeLa celler og Nevron-astrocytter blandet kulturer belagt på glass coverslips. Ca2 + tenkelig teknikk med GECIs angitt her, Lck-GCaMP6f, plasma membran-målrettede RCaMP210 (Lck-RCaMP2), og OER-GCaMP6f (figur 1) gjelder for alle celler som disse GECIs kan uttrykkes.
Variert biologisk utganger er initiert av Ca2 + signaler. Ca2 + er en allsidig intracellulær signalnettverk messenger. Dekoding av Ca2 + signaler å fremkalle bestemt utganger har vært et grunnleggende biologisk spørsmål Ca2 + imaging teknikker å beskrive mangfoldet av Ca2 + signaler er nødvendig. Øyeblikket detaljert protokollen gjør at påvisning av forskjellige Ca2 + signaler i plasma membranen og ER (Figur 3 og Figur 4) og lokale Ca2 + microdomains inne i en celle (Figur 4 og figur 5). Dette bidrar til å beskrive mangfoldet av intracellulær Ca2 + signaler. Timelige oppløsningen av Ca2 + signaler ble også forbedret av målretting GECIs i plasma membranen og ER fordi den kan unngå effekten av en tredimensjonal spredning av Ca2 + og GECIs seg, og den har potensial til å oppdage den øyeblikk av Ca2 + tilstrømningen eller Ca2 + utgivelse, som oppstår på membranen.
Protokollen har noen begrensninger. Brukere bør huske på at oppdaget signaler er summering av “øyeblikk av Ca2 + tilstrømningen eller release” og “Ca2 + diffust ut fra den opprinnelige Ca2 + kilden”, spesielt for store Ca2 + signaler. For eksempel, selv om hans stimulering i HeLa celler fremkaller Ca slipp2 + fra ER, den resulterende Ca2 + signaler oppdages ikke bare av ER målrettede OER-GCaMP6f, men også av plasma membran-målrettede Lck-RCaMP2 (Figur 3). En annen begrensning er at spatiotemporal mønster av Ca2 + signaler ikke kan være den eneste Determinanten av produksjonen av Ca2 + signaler. Fordelingen av nedstrøms effektor proteiner (for eksempel Ca2 +-avhengige kinaser og phosphatases) kan også være en fastsettelse faktor2. Å fullstendig dekode intracellulær Ca2 + signaler, er analyse av nedstrøms enzym atferd, som ikke dekkes i denne protokollen, absolutt nødvendig.
En av de viktigste aspektene for vellykket Ca2 + imaging er tenkelig oppsett og bilde oppkjøpet forhold, så vel som for andre live-imaging studier. Vi viste tidligere at Ca2 + svar i cellen er svært avhengige varighet og intensitet av eksitasjon og bilde oppkjøpet forhold, herunder eksponering tid og oppkjøp frekvens16. Eksitasjon belysning kraften er den mest kritiske faktoren, som det kan føre til lys giftighet og photobleaching av GECIs. Innspillingen betingelsene for eksponeringstid, frekvens, eksitasjon lav intensitet og varighet av innspillingen skal optimaliseres etter eksperimentet. Det anbefales å redusere eksponeringstid og eksitasjon lysintensiteten så mye som mulig for å unngå photobleaching og Phototoksisitet til cellen. Innspillingen hyppigheten og varigheten av innspillingen bør være tilstrekkelig til å dekke Ca2 + høyde hendelsene rundt men bør holdes så lavt som mulig for å unngå photobleaching og Phototoksisitet også. Vi anbefaler å bestemme opptak hyppigheten og varigheten først og optimalisere lysintensiteten og eksponeringstid, slik at photobleaching av GECIs er minimert. En annen viktig faktor er det uttrykket GECIs. GECIs har en Ca2 +-bufring effekt som de er Ca2 +-bindende proteiner. Derfor, overuttrykte GECIs resulterer i bufring av Ca2 +, som er fysiologisk nødvendig for cellene. Mengden av GECI uttrykk bør minimaliseres for å unngå tenkelig celler uttrykke store mengder GECIs.
Avslutningsvis er Disseksjon av Ca2 + signaler på en subcellular løsning en av de viktigste trinnene for dekoding intracellulær Ca2 + signaler som bestemmer det produksjon biologiske fenomenet. Denne protokollen gir en ny metode for Disseksjon av Ca2 + signaler å beskrive mangfoldet blant disse signalene. Denne teknikken er for tiden begrenset ved in vitro eksperimenter. Men Lck-GCaMP6f brukes allerede for i vivo Ca2 + bildebehandling i mus17, og OER-GCaMP6f ble bekreftet å overvåke Ca2 + signaler i vivo i VD motor neurons i C. elegans7. Derfor har målretting GECIs i subcellular rommet potensial til å bli utvidet til i vivo imaging i fremtiden, dermed muliggjør Ca2 + disseksjon i vivo.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet er støttet av følgende tilskudd: Japan vitenskap og teknologi Agency (JSO) / Precursory forskning for embryonale vitenskap og teknologi (PRESTO) (JPMJPR15F8, Japan); Japan Society for fremme av vitenskap (JSPER) / gir bistand til vitenskapelig forskning (KAKENHI) (JP18H05414, JP17H05710, JP16K07316), Takeda Foundation. Forfatterne takker Haruhiko Bito (Universitetet i Tokyo) for å gi RCaMP2 og Arthur J.Y. Huang og Thomas McHugh (RIKEN CBS) gir AAV vektorer eller instruksjoner om AAV forberedelse. Forfatterne vil også gjerne takke redaktører på Journal av visualisert eksperimenter for deres hjelp med filming og redigering.
(RS)-3,5-Dihydroxyphenylglycine (DHPG) | Tocris | #0342 | |
0.5% DNase I stock solution | Sigma-Aldrich | #11284932001 | Prepare 0.5% DNase I (w/v) in Hanks' Balanced Salt Solution supplemented with 120 mM MgSO4. Prepare 160 µL aliquots and store at -30°C. |
0.5% Trypsin-EDTA solution | Thermo Fisher Scientific | #25300054 | |
100 mM L-glutamine (×100 stock) | Thermo Fisher Scientific | #25030081 | Preparing small aliquots of 250–750 µL and store at -30°C. |
100 mM Sodium pyruvate (×100 stock) | Thermo Fisher Scientific | #11360070 | Aliquots (10 mL) can be stored at -20°C. After thawing, the solution can be maintained at 4°C for 2 months. |
12-Well multiwell culture plates with low-evaporation lid | Falcon | #353043 | Low-evaporation lid is critical for culturing neuron-glia mixed culture. For cell line cells, alternative culture dishes can be used. |
18-mm diameter circular coverslips | Karl Hecht "Assistent" | #41001118 | Thickness 1, 18-mm diameter circular coverslips; alternative coverslips can be used. |
1M HEPES | Thermo Fisher Scientific | #15630080 | pH 7.2 – 7.6 |
2.5% Trypsin stock solution (×20 stock) | Sigma-Aldrich | #T4674 | Prepare 150 µL aliquot and store at -30°C. |
50% Poly(ethyleneimine) (PEI) solution | Sigma-Aldrich | #P3143 | Prepare 2% (V/V) PEI stock solution (×50) with distilled water sterilized by filtration. Store stock solution at -30°C after preparing small aliquots of 250-750 µL. Prepare 0.04% PEI solution with distilled water on the day of coverslip coating. |
70% Ethanol | Kept in a spray bottle to be used for surface disinfection. | ||
Adeno-associated virus (AAV) for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under the direction of the EF1a promoter | AAV can be prepared using AAV Helper Free System (Agilent Technologies) and HEK293 cells, or alternative methods. pAAV.EF1a.Lck-GCaMP6f, pAAV.EF1a.Lck-RCaMP2, and pAAV.EF1a.OER-GCaMP6f are available upon request. | ||
B-27 supplement (×50 stock) | Thermo Fisher Scientific | #17504044 | This can be replaced by B-27 plus supplement (Thermo Fisher Scientific; #A3582801) or MACS NeuroBrew-21 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany; #130-093-566). |
B57BL/6 | Japan SLC, Inc. | ||
Camera for microscopic image recording | The following cameras were available for use: cooled-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics, OECA-ER), EM-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics, ImagEM; Andor, iXon) or CMOS camera (e.g., Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0) | ||
Cell freezing container | Sarstedt K.K. | #95.64.253 | Alternative cell freezing container can be used. |
Cell strainer | Falcon | #352350 | |
CO2 incubator | Maintain at 37°C, 5% CO2. | ||
Cryogenic tube | Corning | #430661 | Alternative cryogenic tubes can be used. |
Cryopreservation medium | Zenoaq | "CELLBANKER1" | |
Culture medium (for HeLa cells) | Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum, and penicillin-streptomycin solution (final concentration: Penicillin 100 units/mL and Streptomycin 100 µg/mL) | ||
Dissection medium | One milliliter of 1 M HEPES (final concentration 20 mM) to 49 mL DMEM | ||
DMEM | Nacalai | #08456-65 | Alternative DMEM can be used. |
DMEM | Nacalai | #08456-65 | Low glucose |
DNA transfection reagent | Sigma-Aldrich | #6366244001 | "X-tremegene HP DNA transfection reagent" Alternative transfection reagents can be used. |
Glass jar with a lid | 500 mL jar (for mouse) or 1500 mL jar (for rat) to anesthetize the animal | ||
HBSS | Thermo Fisher Scientific | #14170161 | HBSS free of calcium and magnesium |
Heat inactivated bovine serum | Thermo Fisher Scientific | #10100147 | |
HeLa cells | RIKEN BioResource Center | #RCB0007 | |
Histamine | Sigma-Aldrich | #H7125 | |
Image analysis software | Such as Metamorph (Molecular Devices), Image J (NIH), and TI Workbench14 (custom made) | ||
Image splitting optics | Hamamatsu Photonics | #A12801-01 | W-view GEMINI |
Image splitting optics dichroic mirror | Semrock | #FF560-FDi01-25×36 | For separation of green fluorescent protein/red fluorescent protein (GFP/RFP) signal |
Image splitting optics emission filters | Semrock | #FF01-512/25-25, #FF01-630/92-25 | For emission of GFP/RFP signal, respectively |
Imaging medium and buffer | Use optimal medium or buffer for the experiment. When medium is used, medium without phenol red is desirable to reduce background fluorescence. Add 20 mM HEPES to maintain pH outside of CO2 incubator. | ||
Incubation saline | Add 1 mL of 1 M HEPES (20 mM) to 49 mL HBSS | ||
Inverted fluorescence microscope | Such as IX73 (Olympus) or Eclipse TI (Nikon Instech) | ||
Isoflurane | Pfizer | Used for anesthesia | |
Maintenance medium (for 4 × 12 well dishes) | 48.5 mL Neurobasal-A medium supplemented with 1 mL B-27, 500 µL of L-glutamine stock and 25 µL Penicillin-Streptomycin solution. | ||
Maintenance medium for frozen cortical cells (for 1 × 12 well dishes) | 12.2 mL Neurobasal plus medium supplemented with 250 µL B-27, 125 µL of L-glutamine stock and 6.2 µL Penicillin-Streptomycin solution. | ||
MEM (Minimum Essential Medium) | Thermo Fisher Scientific | #11090-081 | |
Microscope filter set for GCaMP6f imaging | Appropriate filter for GFP (excitation, 480 ± 10 nm; emission, 530 ± 20 nm) | ||
Microscope filter set for RCaMP2 imaging | Appropriate filter for RFP (excitation, 535 ± 50 nm; emission, 590 nm long pass) | ||
Microscope filter sets for double imaging of RCaMP2 and GCaMP6f | Semrock | #FF01-468/553-25, #FF493/574-FDi01-25×36, #FF01-512/630-25 | Dual excitation filter, Dual dichroic mirror, and emission filter for GFP/RFP imaging. |
Microscope heating system | A heating system to maintain cells at 37°C during the imaging. To avoid drift caused by thermal expansion, heating systems covering the entire microscope itself (e.g., Tokai Hit, Thermobox) are recommended. | ||
Microscope light source for excitation | Mercury lamp (100 W), xenon lamp (75 W), Light-emitting diode (LED) illumination system (e.g., CoolLED Ltd., precisExcite; Thorlabs Inc., 4-Wavelength LED Source; Lumencor, SPECTRA X light engine). In case of mercury lump and xenon lamp, use ND filter to reduce the excitation intensity. | ||
Microscope objective lens | Plan-Apochromat oil immersion objective with numerical aperture higher than 1.3 is highly recommended for the recording of spontaneous Ca2+ activity in neurons and astrocytes. | ||
Neurobasal plus medium | Thermo Fisher Scientific | #A3582901 | |
Neurobasal-A Medium | Thermo Fisher Scientific | #10888022 | Neurobasal plus medium (Thermo Fisher, A3582901) can be used instead of Neurobasal-A medium. |
PBS(-): Phosphate-buffered saline free of Ca2+ and Mg2+ | Fujifilm Wako Pure Chemical Cooperation | #164-23551 | The absence of Ca2+ and Mg2+ is critical not to inhibit the trypsin activity. An alternative to PBS(-) can be used. |
PC and image acquisition software | Such as Metamorph (Molecular Devices); Micromanager; TI Workbench14. | ||
Penicillin-Streptomycin solution | Thermo Fisher Scientific | #15140122 | Penicillin 10,000 units/mL and Streptomycin 10,000 µg/mL |
Plasmid for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under cytomegalovirus promoter 7-9 | Available upon request | ||
Plating medium (for 4 × 12 well dishes) | 48 mL MEM supplemented with 1 mL B-27 supplement, 500 µL L-glutamine stock (final concentration: 2 mM), 500 µL of sodium pyruvate stock (1 mM) and 25 µL Penicillin-Streptomycin solution (penicillin 5 u/mL, streptomycin 5 µg/mL). This concentration of Penicillin-Streptomycin, which is 1/20 of the concentration recommended by the manufacturer, is critical for neuronal survival. | ||
Recording chamber | Elveflow | Ludin Chamber | This recording chamber is for 18 mm diameter round coverslips. |
Reduced serum media | Thermo Fisher | #11058021 | Opti-MEM |
Stereomicroscope | Used to dissect hippocampi. Olympus SZ60 or equivalent stereomicroscopes are available. | ||
Surgical instruments | Standard dissecting scissors to cut the abdomen of a mouse or a rat, tweezers to pinch the uterus, delicate dissecting scissors to cut the uterus and the head of embryo, ring forceps to pinch the embryos, 13-cm curved Semken forceps (Fine Science Tools #11009-13) to extract brains, 3 forceps with fine tips (Dumont Inox #5) | ||
Transfection reagent for neuron | Thermo Fisher Scientific | #L3000008 | "Lipofectamine 3000" reagent. It is composed of the the "supplement (P3000)" that should be mixed with plasmid DNA in the step 2.2.3, and the "transfection reagent (lipofectamine 3000)" used in the step 2.2.4. |
Trypan blue (0.4%) | Thermo Fisher Scientific | #15250061 | |
Wash medium for frozen cortical cells | 25 mL DMEM, supplemented with 250 µL heat-inactivated fetal bovine serum + 12.5 µL Penicillin Streptomycin. | ||
Wistar rats | Japan SLC, Inc | Pregnant rats (E18) |