Här presenterar vi ett protokoll för Ca2 + imaging i nervceller och stödjeceller, som gör dissektion av Ca2 + signaler på subcellulär upplösning. Denna process är tillämplig på alla typer av celler som tillåter uttrycket av genetiskt kodade Ca2 + indikatorer.
Kalciumjon (Ca2 +) är en universal intracellulära budbärare molekyl som driver flera signalvägar, leder till olika biologiska utgångar. Samordning av två Ca2 + signalkällor — ”Ca2 + tillströmningen” från utanför cellen och ”Ca2 + release” från den intracellulära Ca2 + lagra endoplasmatiska nätverket (ER) — anses ligga till grund för de olika plats och tid mönster av Ca 2 + signaler som orsakar flera biologiska funktioner i celler. Syftet med detta protokoll är att beskriva en ny Ca2 + bildgivande metod som möjliggör övervakning av ögonblicket av ”Ca2 + tillströmning” och ”Ca2 + release”. OER-GCaMP6f är en genetiskt kodade Ca2 + indikator (GECI) bestående av GCaMP6f, vilken är måltavlan till ER yttre membranet. OER-GCaMP6f kan övervaka Ca2 + release på en högre temporal upplösning än konventionella GCaMP6f. Kombinerat med plasmamembranet-riktade GECIs, kan plats och tid Ca2 + signal mönstret beskrivas med en subcellulär upplösning. Subcellulär-riktade Ca2 + indikatorerna som beskrivs här är, i princip, tillgänglig för alla celltyper, även för de i vivo imaging Caenorhabditis elegans nervceller. I detta protokoll, vi införa Ca2 + imaging i celler från cellinjer, neuron och gliaceller i dissocierade primära kulturer och beskriva utarbetandet av fryst lager av råtta kortikala nervceller.
Ca2 + signaler representerar höjden av intracellulära Ca2 + koncentrationen. Ca2 + är universal andra messenger för eukaryota celler. Använda Ca2 +, celler fungera via olika intracellulära signalvägar och framkalla olika biologiska effekter. Till exempel i nervceller, synaptiskt vesikelprotein release i presynaptiska terminalen genuttryck i nucleus och induktion av synaptisk plasticitet vid postsynapse regleras av distinkta Ca2 + signaler som just aktiverar lämpliga nedströms enzymer på rätt platser och med exakt timing1.
Särskilda spatiotemporal mönster av Ca2 + signaler aktivera de specifika enzymerna som nedströms. Ca2 + signaler genereras av samordningen mellan två olika Ca2 + källor: Ca2 + tillströmning från den extracellulära och Ca2 + release från endoplasmatiska retiklet (ER), som fungerar som en intracellulära Ca2 + lagra. Meningsfull spatiotemporal Ca2 + signalering mönstret att framkalla en viss cellfunktion stöds också av nanodomains av 10-100 µM Ca2 + genereras i närheten av Ca2 + kanaler på plasmamembranet eller ER membran2. Viktigt, är källan till Ca2 + signaler en av de mest kritiska faktorer som avgör nedströms biologiska utdata. I nervceller har Ca2 + tillströmning och Ca2 + release motsatta effekter på klustring av gamma – aminosmörsyra (GABA)A receptorer (GABAAR) på GABAergic synapserna, som ansvarar för hämning av neuronal excitabilitet3. Ca2 + tillströmning åtföljs av massiva neuronala excitation inducerar spridningen av synaptic GABAAR-kluster, medan ihållande Ca2 + släppa från ER främjar den klustring av synaptic GABAARs. Andra grupper har också rapporterat att trim riktning mot tillväxt kottar är kritiskt beroende av källan till Ca2 + signalen: Ca2 + tillströmning inducerar repulsion, medan Ca2 + release guidar attraktion av neuronal tillväxt kon4. Därför, för att fullt ut förstå den Ca2 + signalering vägar underliggande specifika cellulära utgångar, det är viktigt att identifiera källan till Ca2 + signaler genom att beskriva Ca2 + signaler med subcellulär upplösning.
I detta protokoll beskriver vi en Ca2 + bildgivande metod för att rapportera Ca2 + signaler på subcellulär resolutionen, som tillåter skattning av de Ca2 + signalkällorna (figur 1). Ca2 + microdomains precis under plasmamembranet övervakas framgångsrikt av genetiskt kodade Ca2 + indikatorer (GECIs) riktade till plasmamembranet via tillbehöret av plasmamembran-lokalisering signalen Lck inom Src Kinas till N-termini GECIs5. För att upptäcka mönster i närheten av ER en bättre rumsliga och temporal upplösning Ca2 + signal, utvecklade vi nyligen OER-GCaMP6f, i vilken GCaMP6f6 mål ER yttre membran, med ER transmembrane protein. OER-GCaMP6f kan känsligt rapportera Ca2 + release från ER med bättre spatiotemporal upplösning än konventionella nontargeted GCaMP6f COS-7 celler7 och HEK293 celler8, genom att undvika diffusion av Ca2 + och GECIs . Vi bekräftade också att spontan Ca2 + höjden i odlade Hippocampus astrocyter som rapporterats av OER-GCaMP6f visade olika spatiotemporal mönster jämfört med som övervakas av plasmamembran-riktade GCaMP6f (Lck-GCaMP6f)7 ,9, vilket indikerar att Ca2 + imaging med OER-GCaMP6f i kombination med Lck-GCaMP6f bidrar till dissektion av Ca2 + signaler med subcellulär upplösning att identifiera sina källor.
För närvarande detalj vi protokollet för dissekering i HeLa cells och neuron-astrocyten blandas kulturer pläterade på glas coverslips Ca2 + signal. Den Ca2 + bildteknik med GECIs anges här, Lck-GCaMP6f, plasma membran-riktade RCaMP210 (Lck-RCaMP2), och OER-GCaMP6f (figur 1) är tillämpliga på alla celler där dessa GECIs kan uttryckas.
Olika biologiska utgångar initieras av Ca2 + signaler. Ca2 + är en mångsidig Intracellulär signalering budbärare. Avkodning Ca2 + signaler att framkalla specifika utgångar har varit en grundläggande biologisk fråga, och Ca2 + avbildningstekniker att beskriva mångfalden av Ca2 + signaler krävs. För närvarande detaljerad protokollet möjliggör upptäckt av distinkta Ca2 + signaler vid plasmamembranet och ER (figur 3 och figur 4) och lokala Ca2 + microdomains inuti en cell (figur 4 och figur 5). Detta bidrar till att beskriva mångfalden av intracellulära Ca2 + signaler. Den temporal upplösningen av Ca2 + signaler förbättrades också genom att rikta GECIs i plasmamembranet och ER eftersom det undviker effekten av ett tredimensionellt diffusion av Ca2 + och GECIs själva, och har potential att upptäcka den ögonblick av Ca2 + tillströmning eller Ca2 + release, vilket sker på membranet.
Protokollet har vissa begränsningar. Användare bör ha i åtanke att de upptäckta signalerna är summan av ”ögonblicket av Ca2 + tillströmning eller release” och ”Ca2 + sprids ut från den ursprungliga Ca2 + källan”, särskilt för stora Ca2 + signaler. Till exempel, även om hans stimulering i HeLa cells frammanar Ca släppa2 + från ER, dess resulterande Ca2 + signaler upptäcks inte bara av ER riktade OER-GCaMP6f utan också av plasma-membran-targeted Lck-RCaMP2 (figur 3). En annan begränsning är att spatiotemporal mönstret av Ca2 + signaler inte kan vara den enda faktorn av produktionen av Ca2 + signaler. Fördelningen av nedströms effektor proteiner (som Ca2 +-beroende kinaser och fosfataser) kan också vara en avgörande faktorn2. Avkoda helt de intracellulära Ca2 + signalerna genom är analys av nedströms enzym beteende, som inte omfattas av detta protokoll, absolut nödvändigt.
En av de mest kritiska aspekterna för framgångsrika Ca2 + imaging är tänkbar setup och bild förvärv förhållanden, såväl när det gäller andra live-imaging studier. Vi har tidigare visade att Ca2 + svaren i cellen är starkt beroende på varaktighet och intensitet av excitation och på bild förvärv villkor, inklusive exponering tid och förvärvet frekvens16. Magnetiseringen belysning makt är den mest kritiska faktorn, eftersom det kan orsaka lätta toxicitet och fotoblekning av GECIs. Inspelningsförhållandena för exponeringstid, inspelning frekvens, excitation ljus intensitet och varaktighet för inspelning bör optimeras enligt syftet med experimentet. Vi rekommenderar att minska exponeringstiden och excitation ljusintensiteten som möjligt att undvika fotoblekning och fototoxicitet till cellen. Inspelning frekvensen och varaktigheten av inspelning bör vara tillräckliga för att täcka de Ca2 + höjd händelserna av intresse men bör hållas så låg som möjligt för att undvika fotoblekning och fototoxicitet också. Vi rekommenderar att fastställa inspelning frekvensen och varaktigheten först och optimerar ljusintensiteten och exponeringstiden så att fotoblekning av GECIs minimeras. En annan viktig faktor är den uttryck i GECIs. GECIs har en Ca2 +-buffring effekten som de är Ca2 +-bindande proteiner. Därför resulterar i överuttryck av GECIs i buffringen av Ca2 +, vilket är fysiologiskt nödvändigt för cellerna. Mängden GECI uttryck bör minimeras för att undvika imaging celler som uttrycker stora mängder GECIs.
Sammanfattningsvis, är dissektion av Ca2 + signaler på en subcellulär resolution en av de viktigaste stegen för avkodning intracellulära Ca2 + signaler som avgör produktionen biologiska fenomen. Detta protokoll ger en ny metod för dissektion av Ca2 + signaler att beskriva mångfalden bland dessa signaler. För närvarande, är denna teknik begränsad för in vitro-försök. Dock Lck-GCaMP6f används redan för Invivo Ca2 + imaging i möss17och OER-GCaMP6f bekräftades för att övervaka Ca2 + signaler in vivo i de VD motoriska nervcellerna i C. elegans7. Inriktning GECIs i subcellulär facket har därför potential att utökas till i vivo imaging i framtiden, således möjliggör Ca2 + dissektion Invivo.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av följande bidrag: det Japan Science and Technology Agency (JST) / Precursory forskning för embryonala vetenskap och teknik (PRESTO) (JPMJPR15F8, Japan); Japan Society för främjande av vetenskap (JSPS) / bidrag i stöd till vetenskaplig forskning (KAKENHI) (JP18H05414, JP17H05710, JP16K07316), Takeda Foundation. Författarna tackar Haruhiko Bito (University of Tokyo) för att tillhandahålla RCaMP2 och Arthur J.Y. Huang och Thomas McHugh (RIKEN CBS) för att tillhandahålla AAV vektorer och anvisningar angående AAV förberedelse. Författarna vill även tacka redaktörer på Journal av visualiseras experimenten för hjälp med video Filmning och redigering.
(RS)-3,5-Dihydroxyphenylglycine (DHPG) | Tocris | #0342 | |
0.5% DNase I stock solution | Sigma-Aldrich | #11284932001 | Prepare 0.5% DNase I (w/v) in Hanks' Balanced Salt Solution supplemented with 120 mM MgSO4. Prepare 160 µL aliquots and store at -30°C. |
0.5% Trypsin-EDTA solution | Thermo Fisher Scientific | #25300054 | |
100 mM L-glutamine (×100 stock) | Thermo Fisher Scientific | #25030081 | Preparing small aliquots of 250–750 µL and store at -30°C. |
100 mM Sodium pyruvate (×100 stock) | Thermo Fisher Scientific | #11360070 | Aliquots (10 mL) can be stored at -20°C. After thawing, the solution can be maintained at 4°C for 2 months. |
12-Well multiwell culture plates with low-evaporation lid | Falcon | #353043 | Low-evaporation lid is critical for culturing neuron-glia mixed culture. For cell line cells, alternative culture dishes can be used. |
18-mm diameter circular coverslips | Karl Hecht "Assistent" | #41001118 | Thickness 1, 18-mm diameter circular coverslips; alternative coverslips can be used. |
1M HEPES | Thermo Fisher Scientific | #15630080 | pH 7.2 – 7.6 |
2.5% Trypsin stock solution (×20 stock) | Sigma-Aldrich | #T4674 | Prepare 150 µL aliquot and store at -30°C. |
50% Poly(ethyleneimine) (PEI) solution | Sigma-Aldrich | #P3143 | Prepare 2% (V/V) PEI stock solution (×50) with distilled water sterilized by filtration. Store stock solution at -30°C after preparing small aliquots of 250-750 µL. Prepare 0.04% PEI solution with distilled water on the day of coverslip coating. |
70% Ethanol | Kept in a spray bottle to be used for surface disinfection. | ||
Adeno-associated virus (AAV) for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under the direction of the EF1a promoter | AAV can be prepared using AAV Helper Free System (Agilent Technologies) and HEK293 cells, or alternative methods. pAAV.EF1a.Lck-GCaMP6f, pAAV.EF1a.Lck-RCaMP2, and pAAV.EF1a.OER-GCaMP6f are available upon request. | ||
B-27 supplement (×50 stock) | Thermo Fisher Scientific | #17504044 | This can be replaced by B-27 plus supplement (Thermo Fisher Scientific; #A3582801) or MACS NeuroBrew-21 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany; #130-093-566). |
B57BL/6 | Japan SLC, Inc. | ||
Camera for microscopic image recording | The following cameras were available for use: cooled-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics, OECA-ER), EM-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics, ImagEM; Andor, iXon) or CMOS camera (e.g., Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0) | ||
Cell freezing container | Sarstedt K.K. | #95.64.253 | Alternative cell freezing container can be used. |
Cell strainer | Falcon | #352350 | |
CO2 incubator | Maintain at 37°C, 5% CO2. | ||
Cryogenic tube | Corning | #430661 | Alternative cryogenic tubes can be used. |
Cryopreservation medium | Zenoaq | "CELLBANKER1" | |
Culture medium (for HeLa cells) | Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum, and penicillin-streptomycin solution (final concentration: Penicillin 100 units/mL and Streptomycin 100 µg/mL) | ||
Dissection medium | One milliliter of 1 M HEPES (final concentration 20 mM) to 49 mL DMEM | ||
DMEM | Nacalai | #08456-65 | Alternative DMEM can be used. |
DMEM | Nacalai | #08456-65 | Low glucose |
DNA transfection reagent | Sigma-Aldrich | #6366244001 | "X-tremegene HP DNA transfection reagent" Alternative transfection reagents can be used. |
Glass jar with a lid | 500 mL jar (for mouse) or 1500 mL jar (for rat) to anesthetize the animal | ||
HBSS | Thermo Fisher Scientific | #14170161 | HBSS free of calcium and magnesium |
Heat inactivated bovine serum | Thermo Fisher Scientific | #10100147 | |
HeLa cells | RIKEN BioResource Center | #RCB0007 | |
Histamine | Sigma-Aldrich | #H7125 | |
Image analysis software | Such as Metamorph (Molecular Devices), Image J (NIH), and TI Workbench14 (custom made) | ||
Image splitting optics | Hamamatsu Photonics | #A12801-01 | W-view GEMINI |
Image splitting optics dichroic mirror | Semrock | #FF560-FDi01-25×36 | For separation of green fluorescent protein/red fluorescent protein (GFP/RFP) signal |
Image splitting optics emission filters | Semrock | #FF01-512/25-25, #FF01-630/92-25 | For emission of GFP/RFP signal, respectively |
Imaging medium and buffer | Use optimal medium or buffer for the experiment. When medium is used, medium without phenol red is desirable to reduce background fluorescence. Add 20 mM HEPES to maintain pH outside of CO2 incubator. | ||
Incubation saline | Add 1 mL of 1 M HEPES (20 mM) to 49 mL HBSS | ||
Inverted fluorescence microscope | Such as IX73 (Olympus) or Eclipse TI (Nikon Instech) | ||
Isoflurane | Pfizer | Used for anesthesia | |
Maintenance medium (for 4 × 12 well dishes) | 48.5 mL Neurobasal-A medium supplemented with 1 mL B-27, 500 µL of L-glutamine stock and 25 µL Penicillin-Streptomycin solution. | ||
Maintenance medium for frozen cortical cells (for 1 × 12 well dishes) | 12.2 mL Neurobasal plus medium supplemented with 250 µL B-27, 125 µL of L-glutamine stock and 6.2 µL Penicillin-Streptomycin solution. | ||
MEM (Minimum Essential Medium) | Thermo Fisher Scientific | #11090-081 | |
Microscope filter set for GCaMP6f imaging | Appropriate filter for GFP (excitation, 480 ± 10 nm; emission, 530 ± 20 nm) | ||
Microscope filter set for RCaMP2 imaging | Appropriate filter for RFP (excitation, 535 ± 50 nm; emission, 590 nm long pass) | ||
Microscope filter sets for double imaging of RCaMP2 and GCaMP6f | Semrock | #FF01-468/553-25, #FF493/574-FDi01-25×36, #FF01-512/630-25 | Dual excitation filter, Dual dichroic mirror, and emission filter for GFP/RFP imaging. |
Microscope heating system | A heating system to maintain cells at 37°C during the imaging. To avoid drift caused by thermal expansion, heating systems covering the entire microscope itself (e.g., Tokai Hit, Thermobox) are recommended. | ||
Microscope light source for excitation | Mercury lamp (100 W), xenon lamp (75 W), Light-emitting diode (LED) illumination system (e.g., CoolLED Ltd., precisExcite; Thorlabs Inc., 4-Wavelength LED Source; Lumencor, SPECTRA X light engine). In case of mercury lump and xenon lamp, use ND filter to reduce the excitation intensity. | ||
Microscope objective lens | Plan-Apochromat oil immersion objective with numerical aperture higher than 1.3 is highly recommended for the recording of spontaneous Ca2+ activity in neurons and astrocytes. | ||
Neurobasal plus medium | Thermo Fisher Scientific | #A3582901 | |
Neurobasal-A Medium | Thermo Fisher Scientific | #10888022 | Neurobasal plus medium (Thermo Fisher, A3582901) can be used instead of Neurobasal-A medium. |
PBS(-): Phosphate-buffered saline free of Ca2+ and Mg2+ | Fujifilm Wako Pure Chemical Cooperation | #164-23551 | The absence of Ca2+ and Mg2+ is critical not to inhibit the trypsin activity. An alternative to PBS(-) can be used. |
PC and image acquisition software | Such as Metamorph (Molecular Devices); Micromanager; TI Workbench14. | ||
Penicillin-Streptomycin solution | Thermo Fisher Scientific | #15140122 | Penicillin 10,000 units/mL and Streptomycin 10,000 µg/mL |
Plasmid for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under cytomegalovirus promoter 7-9 | Available upon request | ||
Plating medium (for 4 × 12 well dishes) | 48 mL MEM supplemented with 1 mL B-27 supplement, 500 µL L-glutamine stock (final concentration: 2 mM), 500 µL of sodium pyruvate stock (1 mM) and 25 µL Penicillin-Streptomycin solution (penicillin 5 u/mL, streptomycin 5 µg/mL). This concentration of Penicillin-Streptomycin, which is 1/20 of the concentration recommended by the manufacturer, is critical for neuronal survival. | ||
Recording chamber | Elveflow | Ludin Chamber | This recording chamber is for 18 mm diameter round coverslips. |
Reduced serum media | Thermo Fisher | #11058021 | Opti-MEM |
Stereomicroscope | Used to dissect hippocampi. Olympus SZ60 or equivalent stereomicroscopes are available. | ||
Surgical instruments | Standard dissecting scissors to cut the abdomen of a mouse or a rat, tweezers to pinch the uterus, delicate dissecting scissors to cut the uterus and the head of embryo, ring forceps to pinch the embryos, 13-cm curved Semken forceps (Fine Science Tools #11009-13) to extract brains, 3 forceps with fine tips (Dumont Inox #5) | ||
Transfection reagent for neuron | Thermo Fisher Scientific | #L3000008 | "Lipofectamine 3000" reagent. It is composed of the the "supplement (P3000)" that should be mixed with plasmid DNA in the step 2.2.3, and the "transfection reagent (lipofectamine 3000)" used in the step 2.2.4. |
Trypan blue (0.4%) | Thermo Fisher Scientific | #15250061 | |
Wash medium for frozen cortical cells | 25 mL DMEM, supplemented with 250 µL heat-inactivated fetal bovine serum + 12.5 µL Penicillin Streptomycin. | ||
Wistar rats | Japan SLC, Inc | Pregnant rats (E18) |