목공 딱정벌레의 부속물을 위한 주사 및 투과 전자 현미경의 시료 제조 방법
Summary
곤충 센실라의 초구조를 관찰하기 위해, 스캐닝 및 투과 전자 현미경(SEM 및 TEM) 시료 준비 프로토콜을 각각 연구에서 발표되었다. Tween 20은 SEM에서 샘플 변형을 피하기 위해 고정식에 첨가되었습니다.
Abstract
이 보고서는 주사 및 투과 전자 현미경 관찰, 목공 딱정벌레, 클로로 포러스 카라가나 Xie & 왕 (2012)의 부속물을 제조하여 입증 된 샘플 준비 방법을 설명, 전자 현미경의 두 가지 유형. 스캐닝 전자 현미경(SEM) 샘플 전처리 프로토콜은 일련의 에탄올 목욕, 건조 및 스퍼터 코팅에서 샘플 화학적 고정, 탈수에 기초하였다. Tween 20(폴리옥시에틸렌 소르비탄 라우레이트)을 고정액 및 세척 용액에 첨가함으로써, 목공 딱정벌레의 곤충 체표면을 SEM에서 보다 깨끗하게 세척하였다. 이 연구의 전송 전자 현미경 검사법 (TEM) 견본 준비는 고착, 에탄올 탈수, 수지에 있는 포함, 형광 현미경 검사법을 사용하여 위치, 단면도 및 염색을 포함하여 일련의 단계를 관련시켰습니다. Tween 20을 이용한 고정제는 트웬(20)이 없었을 때보다 더 쉽게 목공 딱정벌레의 곤충 몸벽을 관통하고, 이어서 체내에 더 나은 고정 조직과 장기를 침투시켜 곤충 센실라 울트라구조의 명확한 투과 전자 현미경 관측을 산출하였다. 이 제제의 다음 단계는 형광 현미경을 사용하여 수지 블록에 내장된 샘플에서 곤충 센실라의 위치를 결정하여 표적 센실라 포지셔닝의 정밀도를 높이는 것이었다. 이렇게 하면 슬라이스 정확도가 향상되었습니다.
Introduction
주사 전자 현미경 검사법은 SEM이 표면 구조를 보여줍니다 많은 형태학 연구에서 중요한 도구입니다1,2. 전송 전자 현미경 검사법의 매력은 세포의 구조와 세포기관의 초구조에서, 거대 분자 복합체 및 단백질의 구조에, 나노 미터 규모에 있는 생물학 구조물의 넓은 범위를 공부하는 것을 이용될 수 있다는 것입니다. TEM은 내부 구조를 보여줍니다3,4,5.
콜레옵테라는 약 182가구와 350,000여 종의 곤충을 포함한 가장 큰 곤충 군이다. 콜레옵테란 곤충의 대부분, 특히 목공 딱정벌레는 식물을 먹고, 그 중 많은 식물은 숲과 과일 나무의 중요한 해충이며, 나무에 치명적인 손상을초래6. 현재, 화학생태이론에 근거한 해충의 예방 및 방제 인구는7. 효율적이고 독성이 낮고 무공해 페로몬 제어 방법이 효과적인방법이되었습니다 8. 곤충의 센실라 형태와 초구조를 연구하는 것은 곤충 화학 생태 연구의 중요한 부분입니다. 스캐닝 및 투과 전자 현미경 검사법 (SEM 및 TEM, 각각)은 그들의 형태및 내부 해부학을 공부하는 큰 효력을 위해 이용됩니다. 그러나, 전자 현미경 검사법(EM)을 위한 곤충 샘플의 제조 도중, 관측 부위의 객관성 및진위도9에영향을 받을 수 있다. 일반적으로 곤충의 SEM 샘플 제제는 세정, 조직 고정, 탈수, 대사, 건조 및 스퍼터코팅(10)을필요로 한다. 나무 보링 딱정벌레가 살고있는 복잡한 환경으로 인해 신체 표면에는 종종 다양한 오염 물질이 있으며 부속물은 종종 많은 미세한 긴 센실라 또는 강모가 있습니다. 특히, 일부 목공은 현장에서 직접 수집 한 실험실 제기에서 사용할 수 없으며 신선도를 보장하기 위해 유체를 고정시키고 실험실에서 세척합니다. 시료가 먼저 고정된 다음 세척되면 글루타랄데히드가 시료에 강하게 고정되기 때문에 이물질을 제거하는 것이 훨씬 더 어렵습니다. 트웬(20)은 계면활성제11,12,13,14,이는 세탁물의 표면 장력을 감소시키고 세탁물의 수면의 습류성을 향상시키는 등 세척 과정에서 중요한 역할을 한다. 본 연구에서, Tween 20은 액체의 표면 장력을 감소시키고, SEM에서 바디 표면을 더 깨끗하게 만든 나무 보링 딱정벌레의 체체 표면에 침전되는 먼지를 방지하기 위해 고정 용액 및 PBS 세정 액에 첨가되었다.
TEM을 사용하여, 곤충의 다른 기관에 센실라는 그 안에 명확한 구조를 밝히기 위하여 슬라이스될 수 있습니다, 따라서 감각증 기능을 분석하기 위한 기초를 제공하. 목공 딱정벌레와 같은 대상 곤충이 크고, 그 몸벽이 경화의 상당 정도를 가지면, 고정제는 곤충 체 내의 장기 조직을 완전히 포화시키지 못할 수 있다. 트위넨(20)은 먼지의 분산 및 현탁용량을 향상시킬 수 있다. 본 연구에서, 트웬(20)은 목초지 딱정벌레의 곤충 체벽내로의 고정유체 침투를 향상시키기 위해 고정식에 첨가하였으며,표피11,12,13의변형 및 붕괴를 피하하였다. 또한, 일반 슬라이스 기술을 사용하면, 특히 일부 작은센실라(15)에대해 다른 유형의 센실라를 정확하게 찾기가 어렵다. 전통적인 TEM 견본 준비에 근거를 두어, 이 연구 결과는 임베디드 블록에 있는 곤충 감각실라의 위치를 결정하기 위하여 형광 현미경 검사법과 SEM을 결합하여, 따라서 슬라이스 정확도를 향상합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 기사에서는 목공 딱정벌레에 대한 주사 및 투과 전자 현미경 검사법을 위한 샘플 준비 계획을 발표했습니다. 곤충 부속을 대표적인 연구 대상자로 사용하여 기존의 시료 전처리 방법에 비해 몇 가지 개선된 방법을 입증했습니다.
고체 표면에서 분리된 액체 오일은 작은 액적으로 유화되어, 이는 물체의 표면에 재증착을 감소시키기 위해 세척 매체에 잘 분산되고 부유될 수…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 베이징 전문 대학, 원자력 응용 연구소 (중국 농업 과학 아카데미), 베이징 임업 대학의 바이오 연구 센터 및 산간 교수의 관대 한 지원에 감사드립니다. 동물학 연구소의 장, 중국 과학 아카데미. 이 연구는 중국의 국가 핵심 R&D 프로그램(2017YFD0600103), 중국 국립자연과학재단(보조금 제31570643, 81774015), 중국 공공복지 산림과학연구(201504304), 내몽골의 지원을 받았습니다. 농업대학 고위인재연구창업계획(203206038) 및 내몽골 자치구 고등교육연구사업(NJZZ18047), 내몽골 자치구 린수 “더블 퍼스트 클래스” 건설사업(170001)
Materials
| Anatomical lens | Chongqing Auto Optical limited liability company |
1425277 | |
| Carbon adhesive tape | SPI Supplies, Division of Structure Probes, Inc. | 7311 | |
| Carbon tetrachloride | Sigma | 56-23-5 | |
| Copper grids | GilderGrids | G300 | |
| Disodium hydrogen phosphate | Sinopharm group chemical reagent co., LTD | 10039-32-4 | |
| Ethanol | J.T. Baker | 64-17-5 | |
| Flat embedding molds | Hyde Venture (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | 70900 | |
| Fluorescence microscope | LEICA | DM2500 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | Anhydrous EM Grade |
| Isophorone | Sigma | 78-59-1 | |
| Lead citrate | Sigma | 512-26-5 | |
| Methanol | Sigma | 67-56-1 | |
| Monobasic sodium phosphate | Its group chemical reagent co., LTD | 7558-80-7 | |
| Objective micrometer | Olympus | 0-001-034 | |
| Osmium tetroxide | Sigma | 541-09-3 | |
| Petri dish | Aldrich | 1998 | |
| Razor blade | Gillette | ||
| Resin | Spurr | ERL4221 | |
| Scalpel | Lianhui | GB/T19001-2008 | |
| SEM | Hitachi | S-3400 | |
| Silica gel desiccant | Suzhou Longhui Desiccant Co., Ltd. | 112926-00-8 | |
| Small brush | Martol | G1220 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 1310-73-2 | |
| Sputter ion instrument | Hitachi Koki Co. Ltd., Tokyo, Japan | E-1010 | |
| Stereo microscope | Leica | EZ4 HD | |
| TEM | Hitachi | H-7500 | |
| Tween 20 | Tianjin Damao Chemical Reagent | 9005-64-5 | |
| Ultramicrotome | Leica | UC6 | |
| Ultrasonic cleaner | GT Sonic | GT-X1 | |
| Uranyl acetate | Sigma | 6159-44-0 |
Referências
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