Esempio di metodo di preparazione del microscopio elettronico di scansione e trasmissione per le appendici di Woodboring Beetle
Summary
Per osservare l’ultrastruttura della sensilla degli insetti, nello studio è stata presentata la microscopia elettronica di scansione e trasmissione (rispettivamente SEM e TEM). Tween 20 è stato aggiunto nel fissativo per evitare la deformazione del campione nella microscopia seM.
Abstract
Questo rapporto ha descritto i metodi di preparazione dei campioni che la scansione e le osservazioni al microscopio elettronico a trasmissione, dimostrati preparando le appendici del coleottero legnoso, Chlorophorus caragana Xie & Wang (2012), per entrambi i tipi di microscopia elettronica. Il protocollo di preparazione del campione di microscopia elettronica a scansione (SEM) si è basato sulla fissazione chimica del campione, sulla disidratazione in una serie di bagni di etanolo, sull’essiccazione e sul rivestimento sputter. Aggiungendo Tween 20 (Polyoxyethylene sorbitan laurate) al fissativo e alla soluzione di lavaggio, la superficie del corpo dell’insetto dello scarabeo legnoso è stata lavata in modo più pulito in SEM. La preparazione del campione di microscopia elettronica a trasmissione (TEM) di questo studio ha comportato una serie di passaggi, tra cui fissazione, disidratazione dell’etanolo, incorporamento in resina, posizionamento mediante microscopia a fluorescenza, sezionamento e colorazione. Fissativo con Tween 20 ha permesso di penetrare la parete del corpo degli insetti di coleottero legnoso più facilmente di quanto lo sarebbe stato senza Tween 20, e successivamente tessuti e organi fissi migliori nel corpo, ha quindi prodotto osservazioni chiare al microscopio elettronico delle ultrastrutture della sensilla degli insetti. Il passo successivo di questa preparazione è stato determinare le posizioni della sensilla degli insetti nel campione incorporato nel blocco di resina utilizzando la microscopia a fluorescenza per aumentare la precisione del posizionamento della sensilla bersaglio. Questo ha migliorato la precisione di taglio.
Introduction
La microscopia elettronica a scansione è uno strumento importante in molti studi di morfologia, che SEM mostra le strutture superficiali1,2. L’appeal della microscopia elettronica a trasmissione è che può essere utilizzata per studiare un’ampia gamma di strutture biologiche su scala nanometrica, dall’architettura delle cellule e l’ultrastruttura degli organelli, alla struttura dei complessi macromolecolari e delle proteine. TEM mostra le strutture interne3,4,5.
Coleoptera è il più grande gruppo di insetti, tra cui circa 182 famiglie e 350.000 specie. La maggior parte degli insetti coleopteraran, in particolare il coleottero che si nutre di piante, molte delle quali sono importanti parassiti di foreste e alberi da frutto, causando danni devastanti agli alberi6. Attualmente, la prevenzione e il controllo della popolazione di parassiti basati sulla teoria dell’ecologia chimica hanno ricevuto una crescente attenzione7. Metodi di controllo dei feromone efficienti, a basso tossico e privo di inquinamento sono diventati un modo efficaceper 8. Studiare la morfologia della sensilla e l’ultrastruttura degli insetti è una parte importante della ricerca sull’ecologia chimica degli insetti. La microscopia elettronica a scansione e trasmissione (rispettivamente SEM e TEM) viene utilizzata con grande effetto per studiarne la morfologia e l’anatomia interna. Tuttavia, durante la preparazione di campioni di insetti per la microscopia elettronica (EM), l’obiettività e l’autenticità del sito di osservazione possono essere influenzate9. In generale, la preparazione del campione SEM degli insetti richiede pulizia, fissazione dei tessuti, disidratazione, metatesi, essiccazione e rivestimento sputter10. A causa dell’ambiente complesso in cui vivono coleotteri in legno, la superficie del corpo ha spesso vari inquinanti e le loro appendici hanno spesso molti sensi o setole lunghe e fini. In particolare, alcuni boscaioli non sono disponibili dall’allevamento di laboratorio, che ha raccolto direttamente sul campo, per poi mettere in liquido di fissaggio per garantire freschezza e successivamente lavati in laboratorio. Se il campione viene prima fissato e poi lavato, ovviamente è molto più difficile rimuovere i detriti perché la glutaraldeide lo fissa fortemente al campione. Tween 20 è un surfactant11,12,13,14, che svolge un ruolo importante nel processo di lavaggio, tra cui la riduzione della tensione superficiale dell’acqua e il miglioramento della umidità dell’acqua sulla superficie del bucato. In questo studio, Tween 20 è stato aggiunto alla soluzione di fissaggio e alla soluzione di pulizia PBS per ridurre la tensione superficiale del liquido e impedire che lo sporco si depositi sulla superficie del corpo del coleottero che lavora, il che ha reso la superficie del corpo più pulita in SEM.
Utilizzando TEM, la sensilla su diversi organi di insetti può essere tagliata per rivelare le strutture chiare al loro interno, fornendo così una base per l’analisi delle funzioni di sensilla. Quando l’insetto soggetto, come il coleottero che lavora nel legno, è grande e la sua parete del corpo ha un notevole grado di sclerotizzazione, quindi il fissativo potrebbe non saturare completamente i tessuti dell’organo all’interno del corpo dell’insetto. Il Tween 20 può migliorare la dispersione e la capacità di sospensione dello sporco. In questo studio, Tween 20 è stato aggiunto al fissativo per migliorare la penetrazione del fluido fissativo nella parete del corpo dell’insetto dello scarabeo legnoso, evitando la deformazione e il collasso dell’epidermi11,12,13. Inoltre, utilizzando la tecnologia generale di affettatura, è difficile individuare con precisione diversi tipi di sensilla, in particolare per qualche piccola sensilla15. Basato sulla preparazione tradizionale del campione TEM, questo studio ha combinato la microscopia a fluorescenza e il SEM per determinare la posizione della sensilla degli insetti nel blocco incorporato, migliorando così la precisione di affettare.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo articolo, abbiamo presentato uno schema di preparazione dei campioni per la microscopia elettronica di scansione e trasmissione per coleottero che falegname. Utilizzando l’appendice degli insetti come soggetto di studio rappresentativo, abbiamo dimostrato diversi miglioramenti rispetto ai metodi tradizionali di preparazione dei campioni.
L’olio liquido staccato dalla superficie solida viene emulsionato in piccole goccioline, che possono essere ben disperse e sospese nel mezzo di lava…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Apprezziamo la generosa assistenza del Beijing Vocational College of Agriculture, dell’Institute for the Application of Atomic Energy (Accademia cinese delle scienze agricole), del Centro di bioricerca dell’Università forestale di Pechino e del professor Shan-gan dell’Istituto di zoologia dell’Accademia Cinese delle Scienze. Questa ricerca è stata sostenuta dal National Key R&D Program of China (2017YFD0600103), dalla National Natural Science Foundation of China (Grant n. 31570643, 81774015), dalla ricerca scientifica forestale nel Welfare pubblico della Cina (201504304), dalla Mongolia Interna della Mongolia Piano di avvio della ricerca sui talenti dell’Università delle Università agricola (203206038) e progetto di ricerca sull’istruzione superiore della Regione Autonoma della Mongolia Interna (NJ-18047), Regione Autonoma Interna linxue “Doppia classe” (170001).
Materials
| Anatomical lens | Chongqing Auto Optical limited liability company |
1425277 | |
| Carbon adhesive tape | SPI Supplies, Division of Structure Probes, Inc. | 7311 | |
| Carbon tetrachloride | Sigma | 56-23-5 | |
| Copper grids | GilderGrids | G300 | |
| Disodium hydrogen phosphate | Sinopharm group chemical reagent co., LTD | 10039-32-4 | |
| Ethanol | J.T. Baker | 64-17-5 | |
| Flat embedding molds | Hyde Venture (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | 70900 | |
| Fluorescence microscope | LEICA | DM2500 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | Anhydrous EM Grade |
| Isophorone | Sigma | 78-59-1 | |
| Lead citrate | Sigma | 512-26-5 | |
| Methanol | Sigma | 67-56-1 | |
| Monobasic sodium phosphate | Its group chemical reagent co., LTD | 7558-80-7 | |
| Objective micrometer | Olympus | 0-001-034 | |
| Osmium tetroxide | Sigma | 541-09-3 | |
| Petri dish | Aldrich | 1998 | |
| Razor blade | Gillette | ||
| Resin | Spurr | ERL4221 | |
| Scalpel | Lianhui | GB/T19001-2008 | |
| SEM | Hitachi | S-3400 | |
| Silica gel desiccant | Suzhou Longhui Desiccant Co., Ltd. | 112926-00-8 | |
| Small brush | Martol | G1220 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 1310-73-2 | |
| Sputter ion instrument | Hitachi Koki Co. Ltd., Tokyo, Japan | E-1010 | |
| Stereo microscope | Leica | EZ4 HD | |
| TEM | Hitachi | H-7500 | |
| Tween 20 | Tianjin Damao Chemical Reagent | 9005-64-5 | |
| Ultramicrotome | Leica | UC6 | |
| Ultrasonic cleaner | GT Sonic | GT-X1 | |
| Uranyl acetate | Sigma | 6159-44-0 |
Referências
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