Induktion und Charakterisierung der pulmonalen Hypertonie bei Mäusen mit dem Hypoxia/SU5416-Modell

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Induktion von pulmonaler Hypertonie (PH) bei Mäusen basierend auf der Exposition gegenüber Hypoxie und der Injektion eines VEGF-Rezeptor-Antagonisten. Die Tiere entwickeln 3 Wochen nach Beginn des Protokolls eine PH- und rechtsventrikuläre (RV) Hypertrophie. Die funktionale und morphometrische Charakterisierung des Modells wird ebenfalls dargestellt.

Abstract

Pulmonale Hypertonie (PH) ist ein pathophysiologischer Zustand, definiert durch einen mittleren pulmonalen arteriellen Druck von mehr als 25 mm Hg im Ruhezustand, wie durch rechte Herzkatheterisierung beurteilt. Ein breites Spektrum von Krankheiten kann zu PH führen, unterschiedlich in ihrer Ätiologie, Histopathologie, klinische Präsentation, Prognose, und Reaktion auf die Behandlung. Trotz erheblicher Fortschritte in den letzten Jahren bleibt PH eine unheilehafte Krankheit. Das Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen kann den Weg für die Entwicklung neuer Therapien ebnen. Tiermodelle sind wichtige Forschungsinstrumente, um dieses Ziel zu erreichen. Derzeit stehen mehrere Modelle zur Rekapitulation von PH zur Verfügung. Dieses Protokoll beschreibt ein PH-Modell mit zwei Treffern. Die Reize für die PH-Entwicklung sind Hypoxie und die Injektion von SU5416, einem vaskulären endotheliaalen Wachstumsfaktor (VEGF)-Rezeptor-Antagonisten. Drei Wochen nach Beginn von Hypoxie/SU5416 entwickeln Tiere eine pulmonale Gefäßumgestaltung, die die histopathologischen Veränderungen imitiert, die bei humanem PH beobachtet wurden (überwiegend Gruppe 1). Die vaskuläre Umgestaltung im Lungenkreislauf führt zur Umgestaltung der rechten Herzkammer (RV). Die Verfahren zur Messung von RV-Drücken (mit Hilfe der Methode der offenen Brust), die morphometrischen Analysen des RV (durch Sezieren und Wiegen beider Herzkammern) und die histologischen Beurteilungen des Umbaus (sowohl pulmonale durch Diekonversion als auch Herz durch Beurteilung der RV-Kardiomyozytenhypertrophie und Fibrose) werden ausführlich beschrieben. Die Vorteile dieses Protokolls sind die Möglichkeit der Anwendung sowohl bei Wildarten als auch bei gentechnisch veränderten Mäusen, die relativ einfache und kostengünstige Umsetzung und die schnelle Entwicklung der Krankheit von Interesse (3 Wochen). Einschränkungen dieser Methode sind, dass Mäuse keinen schweren Phänotyp entwickeln und PH bei Rückkehr zu Normoxia reversibel ist. Prävention, sowie Therapiestudien, können leicht in diesem Modell implementiert werden, ohne die Notwendigkeit von fortgeschrittenen Fähigkeiten (im Gegensatz zu chirurgischen Nagetiermodellen).

Introduction

Pulmonale Hypertonie (PH) ist eine pathophysiologische Erkrankung, definiert durch einen mittleren pulmonalen arteriellen Druck (PA) von mehr als 25 mm Hg im Ruhezustand, wie durch rechte Herzkatheterisierung^1,2beurteilt. Es gibt eine Vielzahl von Krankheiten, die zu PH führen können. Um die PH-assoziierten Bedingungen zu organisieren, wurden mehrere Klassifikationssysteme entwickelt. Die aktuelle klinische Klassifikation kategorisiert die multiplen PH-assoziierten Krankheiten in 5 verschiedene Gruppen¹. Diese Unterscheidung ist von Bedeutung, da verschiedene Gruppen von Patienten Krankheiten haben, die sich in ihrer klinischen Darstellung, Pathologie, Prognose und Reaktion auf Behandlung unterscheiden². Tabelle 1 fasst die aktuelle Klassifikation zusammen, ergänzt durch die grundlegenden histopathologischen Merkmale jeder Krankheit.

Tabelle 1: Überblick über die klinische Klassifikation von PH, zusammen mit den wichtigsten histopathologischen Merkmalen innerhalb der Gruppen. Eignung des Protokolls Hypoxia/SU5416 zur Modellierung von PH. Diese Tabelle wurde von¹⁹geändert. PH: Pulmonale Hypertonie, PAH: Pulmonale arterielle Hypertonie

Trotz erheblicher Fortschritte bei der Behandlung von PH-assoziierten Krankheiten bleibt PH ohne Heilung, mit einer 3-Jahres-Sterblichkeitsrate zwischen 20% und 80%³. Dies zeigt die zwingende Notwendigkeit, die zugrunde liegenden Mechanismen von PH und danach die Entwicklung neuer Therapien zu verstehen, um das Fortschreiten zu verhindern, zu verlangsamen und die Krankheit zu heilen. Tiermodelle sind für diesen Bereich von entscheidender Bedeutung. Derzeit gibt es verschiedene Modelle, um PH zu studieren. Der interessierte Leser wird auf die ausgezeichneten Rezensionen zu diesem Thema^2,3,4verwiesen. Angesichts der Vielzahl von Krankheiten, die zu PH führen, ist es offensichtlich, dass die vielfältigen Bedingungen des menschlichen PH nicht in einem Tiermodell perfekt rekapituliert werden können. Die verfügbaren Tiermodelle können in i) Single-Hit, ii) Two-Hit, iii) Knockout und iv) Overexpression-Modelle³kategorisiert werden. In den Single-Hit-Modellen wird PH durch einen einzigen pathologischen Reiz induziert, während Zwei-Treffer-Modelle zwei pathologische Reize mit dem Ziel kombinieren, schwerere PH zu induzieren und damit die komplexe menschliche Krankheit genauer nachzuahmern. Neben den ätiologischen Unterschieden führen die verschiedenen Reize zu PH-Modellierungsunterschieden, die auch von der Art und dem genetischen Hintergrund der Tiere abhängen⁴.

Eines der am häufigsten verwendeten klassischen PH Nagetiermodelle ist die chronische Hypoxie Modell². Hypoxie ist bekannt, PH beim Menschen sowie bei mehreren Tierarten induzieren. Hypoxie hat den Vorteil, ein physiologischer Stimulus für PH zu sein (Tabelle 1). Während jedoch der Grad der Hypoxie, der zur Induktion von PH bei Nagetieren verwendet wird, viel schwerer ist als beim Menschen, führt die einzelne Beleidigung (Hypoxie) nur zu einer milden Form der vaskulären Umgestaltung. Dies imitiert nicht die Schwere der menschlichen Krankheit. Die Zugabe eines Zweiten Treffers, ein zusätzlicher Stimulus zur Induktion von PH, zeigte vielversprechende Ergebnisse: Die Injektion der Verbindung SU5416 an Nagetiere in Kombination mit dem hypoxischen Stimulus induziert einen schwereren PH-Phänotyp^2,5,6. SU5416 ist ein Inhibitor des vaskulären endotheliaalen Wachstumsfaktors (VEGF)-Rezeptor-2. Es blockiert die VEGF-Rezeptoren und führt zu Endothelzellapoptose. Unter hypoxischen Bedingungen stimuliert dies die Proliferation einer Teilmenge apoptoseresistenter Endothelzellen. Darüber hinaus führt SU5416 zu einer reibungslosen Zellproliferation der Muskelzellen. Die Kombination dieser Effekte führt zu einer pathologischen vaskulären Umgestaltung des Lungenkreislaufs und führt zu erhöhtem PA-Druck und rechtsventrikulärer Umgestaltung^2,5,7. Das Modell wurde zuerst in Ratten⁶ beschrieben und später auf Mäuse^4,5,7angewendet. Das Mausmodell weist im Vergleich zu Ratten eine weniger schwere Gefäßumgestaltung auf. Darüber hinaus, wenn zu Normoxia zurück, PH weiterhin Fortschritte bei Ratten, während bei Mäusen ist es teilweise reversibel.

Das folgende Protokoll beschreibt alle Schritte zur Modellierung von PH bei Mäusen mit der Hypoxia/SU5416-Methode (Planung, Zeitleiste, Ausführung). Zusätzlich wird die Charakterisierung des Modells in diesem Protokoll beschrieben: funktionell (durch invasive Messung des rechten ventrikulären (RV) Drucks mit der offenen Brusttechnik), morphometrisch (durch Sezieren und Wiegen sowohl der rechten und linken Ventrikel als auch histologisch (durch Bewertung des pulmonalen VaskulärenRekonsedes, rechtsventrikulärer Kardiomyozytenhypertrophie und Fibrose).

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Schritte und Methoden können von den Ermittlern auf jeder Erfahrungsebene einfach implementiert werden. Während die funktionellen Messungen des Wohnmobils mit der offenen Brusttechnik (hier beschrieben) nicht die Goldstandardmethode auf dem Gebiet sind, hat es den Vorteil, dass es auch von einem weniger erfahrenen Experimentator schnell erlernt und genau reproduziert werden kann.

Protocol

Vor allen Tierversuchen erhalten Sie die Genehmigung des örtlichen institutionellen Tierpflegeausschusses. Die aktuellen Experimente wurden nach Genehmigung durch das Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der Icahn School of Medicine am Berg Sinai durchgeführt. 1. PH-Induktion Vorbereitung Bevor Sie mit der Studie beginnen, planen Sie sorgfältig das experimentelle Design. Stellen Sie sicher, dass Mäuse gleichzeitig mit der ersten SU5416-Injektion hypoxie …

Representative Results

In diesem Protokoll beschreiben wir detailliert die Erstellung des Hypoxia/SU5416 Modells zur Induktion von PH bei Mäusen. Darüber hinaus beschreiben wir alle notwendigen Schritte zur Durchführung der pulmonalen Gefäß- und Herzbewertung am Ende des Beobachtungszeitraums. Eine Übersicht über das experimentelle Design für dieses Modell ist in Abbildung 1A13,14dargestellt. Mäuse werd…

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt, wie man PH bei Mäusen modellieren kann, indem man zwei pathologische Reize kombiniert: chronische Hypoxie und SU5416-Injektion (Hypoxie/SU5416)¹⁸. Um dieses Mausmodell mit der menschlichen PH-Bedingung zu korrelieren, muss man sich unweigerlich die aktuelle PH-Klassifikation ansehen, die in Tabelle 1dargestellt ist. PH in fast allen Formen ist durch pulmonale Vasokonstriktion und abnorme Proliferation von endothelialen und glatten Muskelzellen gekennz…

Materials

Acetic acid glacial	Roth	3738.1
Acetone, Histology Grade	The Lab Depot	VT110D
ADVantage Pressure-Volume System	Transonic	ADV500
Bouin's solution	Sigma	Ht10132
Cautery System	Fine Science Tools	18000-00
Connection tubing and valves
Cotton-Tipped Applicators	Covidien	8884541300
Coverslips, 24 x50 mm	Roth	1871
Data Acquisition and Analysis	Emka	iox2
Direct Red 80	Sigma	365548-5G
DMSO (Dimethyl Sulfoxide)	Sigma Aldrich	276855
Dry ice
Dumont # 5 forceps	Fine Science Tools	11251-10
Dumont # 7 Fine Forceps	Fine Science Tools	11274-20
Embedding molds	Sigma Aldrich	E-6032
Eosin Solution Aqueous	Sigma	HT110216
Ethanol, laboratory Grade	Carolina Biological Supply Company	861285
Fast Green FCF	Sigma	F7252-5G
Fine scissors	Fine Science Tools	14090-09
Goat Serum	invitrogen	16210-064
Heating pad	Gaymar	T/Pump
Hematoxylin 2	Thermo Scientific	7231
Hypoxic chamber	Biospherix	A30274P
Induction chamber	DRE Veterinary	12570
Intubation catheter (i.v. catheter SurFlash (20 G x 1") )	Terumo	SR*FF2025
Iris scissors	Fine Science Tools	14084-08
Isoflurane	Baxter	NDC-10019-360-40
Isoflurane vaporizer	DRE Veterinary	12432
Mice (C57BL/6)	Charles River
Needles 25 G x 5/8"	BD	305122
OCT	Tissue Tek	4583
PBS (Phosphate Buffered Saline)	Corning	21-031-CV
Piric Acid- Saturated Solution 1.3 %	Sigma	P6744-1GA
Pressure volume catheter	Transonic	FTH-1212B-4018
Retractor	Kent Scientific	SURGI-5001
Static oxygen Controller ProOx 360	Biospherix	P360
SU 5416	Sigma Aldrich	S8442
Surgical Suture, black braided silk, 5.0	Surgical Specialties Corp.	SP116
Surgical tape	3M	1527-1
Syringe 10 ml	BD	303134
Syringes with needle 1 ml	BD	309626
Sytox Green Nuclein Acid Stain	Thermo Scientific	S7020
Tenotomy scissors	Pricon	60-521
Toluol	Roth	9558.3
Ventilator	CWE	SAR-830/P
WGA Alexa Fluor	Thermo Scientific	W11261
Xylene	Roth