Um procedimento passo a passo é descrito para a imobilização sem rótulo de exosomas e vesículas extracelulares de amostras líquidas e sua imagem por microscopia de força atômica (AFM). As imagens de AFM são usadas para estimar o tamanho das vesículas na solução e caracterizar outras propriedades biofísicas.
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Artigo de método
Imagens de vesículas extracelulares por microscopia de força atômica
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os exosomas e outras vesículas extracelulares (EVs) são complexos moleculares constituídos por uma vesícula de membrana lipídica, sua decoração superficial por proteínas de membrana e outras moléculas, e conteúdo Luminal diverso herdado de uma célula-mãe, que inclui RNAs, proteínas e DNAs. A caracterização dos tamanhos hidrodinâmicos de EVs, que depende do tamanho da vesícula e da sua camada coronal formada por decorações superficiais, tornou-se rotineira. Para os exosomas, o menor dos EVs, a diferença relativa entre os tamanhos hidrodinâmico e vesículas é significativa. A caracterização de tamanhos de vesículas pela imagem de microscopia eletrônica de transmissão criogênica (Cryo-TEM), uma técnica de padrão-ouro, continua sendo um desafio devido ao custo do instrumento, a expertise necessária para realizar a preparação da amostra, a imagem e análise de dados, e um pequeno número de partículas muitas vezes observadas em imagens. Uma alternativa amplamente disponível e acessível é a microscopia de força atômica (AFM), que pode produzir dados versáteis sobre geometria tridimensional, tamanho e outras propriedades biofísicas de vesículas extracelulares. O protocolo desenvolvido orienta os usuários na utilização desta ferramenta analítica e delineia o fluxo de trabalho para a análise de EVs pelo AFM, que inclui a preparação da amostra para exames de imagem em forma hidratada ou desictada, a imobilização eletrostática de vesículas em um substrato, aquisição de dados, sua análise e interpretação. Os resultados representativos demonstram que a fixação de EVs na superfície modificada da mica é previsível, customizável, e permite que o usuário obtenha resultados da cola para um grande número vesículas. O dimensionamento de vesículas com base nos dados de AFM foi encontrado para ser consistente com a imagem latente de Cryo-TEM.
Introdução
Vesículas extracelulares (EVs) estão presentes em todos os fluidos corporais, incluindo sangue, urina, saliva, leite e o líquido amniótico. Os exosomas formam uma classe distrital de EVs diferenciada de outros EVs por biogênese endossômica, os marcadores da via endossômica e o menor tamanho entre todos os EVs. O tamanho dos exosomas é relatado frequentemente com variabilidade substancial entre estudos. Os resultados de dimensionamento foram encontrados como dependentes do método, refletindo a diferença nos princípios físicos empregados por diferentes técnicas analíticas para estimar ostamanhos de EV1,2. Por ex....
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Protocolo
1. isolamento de EVs de um biofluide
- Isole EVs por um dos métodos estabelecidos, tais como a ultracentlee diferencial8, a precipitação, ou a cromatografia do tamanho-exclusão9.
- Confirme a presença de biomarcadores de superfície e luminal esperados e a ausência de biomarcadores que indiquem a contaminação cruzada da preparação. Confirme a morfologia do BICAMADA do lipido das partículas isoladas pela microscopia de elétron.
Nota: ao isolar os exosomas, a distribuição de tamanho hidrodinâmico medida pela análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) ou dispersão de luz dinâmica deve....
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Resultados
A fixação de superfície de EVs é uma etapa crítica na seqüência da imagem latente. A imobilização de superfície eletrostática de exosomas, conhecida por ter um potencial zeta negativo, ocorrerá de forma robusta após a modificação do substrato da mica para ter uma carga superficial positiva. Sem o tratamento com NiCl2 para transmitir mudanças de superfície positivas, a imobilização de EVS no substrato foi encontrada para ser ineficaz. A imagem de altura na Figura 10A, adquirida no .......
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Discussão
A imobilização de EVs de um líquido biológico, de uma exploração de superfície, e de uma análise da imagem é as etapas essenciais do protocolo desenvolvido para a caracterização de AFM dos EVs no líquido. O número de vesículas em escalas de imagem AFM com a área de superfície imaged e a concentração superficial das vesículas imobilizadas no substrato. Dado um potencial zeta negativo de EVS e de exossomos18, nós advogamos a fixação eletrostática dos EVS das amostras líquidas ao substrato AFM. A imo.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores reconhecem o apoio financeiro da National Science Foundation (número de prêmio IGERT-0903715), da Universidade de Utah (departamento de engenharia química Seed Grant e do prêmio de bolsa de estudos de pós-graduação), e Skolkovo Institute of Science e tecnologia (Skoltech Fellowship).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Controlador AFM/STM | Nánscope Multimodo V | Bruker | Este controlador do AFM suporta a imagem latente de amostras biológicas no líquido e no ar. |
| Discos metálicos para amostras AFM/STM (10 mm) | TedPella | 16207 | Discos metálicos para amostras no qual um disco de mica é fixado por uma fita dupla face ou outros meios. |
| Discos de mica AFM/STM (10 mm) | TedPella | 50 | Mica V1 de grau mais alto, 0,21 mm (0,0085") de espessura. Intercalado, em pacotes de 10. Pode ser montado em discos AFM/STM. Disponível em quatro diâmetros |
| Sonda AFM para imagens no ar | Bruker | TESP-V2 | Sondas de silicone gravadas de alta qualidade para o modo de rosqueamento e modo sem contato para varredura no ar. |
| Sonda AFM para imagens de amostras macias em líquidos | Bruker | MLCT | Cantilevers de nitreto de silício macio com pontas de nitreto de silício, que são adequados para operação líquida. A faixa de constantes de força permite que os usuários obtenham imagens de amostras extremamente macias no modo de contato, bem como espectroscopia de alta carga versus distância. |
| Fita dupla face | Spectrum | 360-77705 | Usada para fixar o disco de mica no disco de amostra de metal. |
| ExoQuick-TC | System Biosciences | EXOTC50A-1 | ExoQuick-TC é um kit proprietário baseado em polímero projetado para isolamento de exossomos de meios de cultura de tecidos. |
| Suporte de vidro do AFM da ponta de prova para a imagem latente em Bruker líquido | ; MTFML-V2 | Este suporte de sonda de vidro é projetado para escanear em fluido com o AFM Multimodo. O suporte pode ser usado no modo de pico de força de derivação, modo de contato, modo de derivação e modulação de força. A sonda é acionada acusticamente por um oscilador piezo separado para modulação de maior amplitude. O suporte é fornecido com duas portas, conexões necessárias e kit de acessórios para adicionar e remover fluidos. | |
| Instituto Tcheco de Metrologia Gwyddio. | Versão 2.52 | Software Open Source para visualização e análise de campos de dados obtidos por técnicas de microscopia de varredura por sonda. | |
| Papel absorvente sem fiapos | GE Healthcare Whatman | Papel absorvente grau GB003 | Use este papel absorvente para remover NiCl2 após a modificação do substrato da mica. |
| Toalhetes de limpeza sem fiapos | Texwipe | AlphaWipe TX1004 | Use estes toalhetes de poliéster para limpeza de superfícies. |
| Cloreto de níquel (II) (NiCl2) | Sigma-Aldrich | 339350 | Pó usado para fazer 10 mM NiCl2 em água DI |
| Solução salina tamponada com fosfato (1x) | Gibco | 10010023 | PBS, pH 7,4 |
Referências
- Chernyshev, V. S., et al. Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407, 3285-3301 (2015).
- Ramirez, M. I., et al. Technical challenges of working with extracellular vesicles. ....
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Reimpressões e permissões
