شارك تلطيخ الأوعية الدموية والألياف العصبية في الأنسجة الدهنية
Summary
تشكيل السفينة دماء جديدة وتعصيب متعاطفة مع لعب دور محوري في الأنسجة الدهنية ليعيد البناء. ومع ذلك، لا تزال هناك مسائل تقنية في تصور وقياس كمية الأنسجة الدهنية. نقدم هنا بروتوكولا للتسمية بنجاح والكمية مقارنة كثافة الأوعية الدموية والألياف العصبية في مختلف الأنسجة الدهنية.
Abstract
الدراسات التي أجريت مؤخرا قد أبرزت الدور الحاسم للأوعية وتعصيب متعاطفة في الأنسجة الدهنية ليعيد البناء أثناء تطوير السمنة. ولذلك فمن الضروري وضع طريقة سهلة وفعالة لتوثيق التغيرات الدينامية في الأنسجة الدهنية. هنا، نحن تصف نهجاً إيمونوفلوريسسينت تعديل كفاءة المشترك البقع الأوعية الدموية والألياف العصبية في الأنسجة الدهنية. مقارنة بالأساليب التقليدية ووضعت مؤخرا، نهجنا سهلة نسبيا لمتابعة وأكثر كفاءة في وسم الأوعية الدموية والألياف العصبية ذات الكثافة أعلى وأقل الخلفية. وعلاوة على ذلك، دقة أعلى للصور كذلك يسمح لنا بدقة قياس منطقة السفن، ومقدار المتفرعة، وطول الألياف ببرمجيات المصدر المفتوح. وكدليل على استخدام أسلوب لدينا، نحن إظهار تلك الأنسجة الدهنية براون (BAT) يحتوي على كميات أعلى من الأوعية الدموية والألياف العصبية مقارنة بالانسجة الدهنية البيضاء (وات). كذلك تجد أن وات تحت الجلد (سوات) قد بين حدى، المزيد من الأوعية الدموية والألياف العصبية مقارنة بوات البربخيه (أوت). لدينا أسلوب مما يوفر أداة مفيدة للتحقيق في الأنسجة الدهنية ليعيد البناء.
Introduction
الأنسجة الدهنية مفتاح الأيضية ووظائف الغدد الصماء1. أنه يوسع بشكل حيوي أو ينكمش استجابة لمختلف المواد الغذائية تؤكد2. الأنسجة النشطة إعادة عرض عملية تتكون من خطوات مسارات الفيزيولوجية متعددة بما في ذلك الأوعية والتليف وتشكيل ميكرونفيرونمينتس التهاب المحلية2،،من34. قد تؤدي بعض المحفزات المادية، مثل التعرض للبرد وممارسة، تتعاطف مع التنشيط، الأمر الذي يؤدي في نهاية المطاف إلى تشكيل السفينة دماء جديدة وتعصيب متعاطفة في الأنسجة الدهنية5،6. ترتبط هذه العمليات إعادة عرض محكم بالنتائج الاستقلابية الجهازية تشمل حساسية الأنسولين، السمة المميزة للنوع 2 من داء السكري2. وهكذا تصور هذه التغيرات الباثولوجية مهم جداً لفهم الوضع الصحي لكل الأنسجة الدهنية.
تولد الأوعية هو عملية تشكيل السفينة دماء جديدة. منذ الأوعية الدموية توفير الأوكسجين والمغذيات والهرمونات وعوامل النمو للأنسجة، تولد الأوعية اعتبرت خطوة رئيسية في الأنسجة الدهنية ليعيد البناء، الذي تم توثيقه مع تقنيات مختلفة6،7، 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13-ومع ذلك، لا تزال هناك أسئلة حول دقة الصور، وكفاءة إيمونوستينينج، وأساليب القياس الكمي لكثافة السفينة. بالمقارنة مع تشكيل السفينة دماء جديدة، تم التقليل تعصيب في الأنسجة الدهنية لفترة طويلة. ومؤخرا، تسنغ et al. 14 استخدام متقدمة إينترافيتال اثنين-فوتون مجهرية وأثبتت أن adipocytes تكون محاطة بطبقات من الألياف العصبية14. ومنذ ذلك الحين، بدأ الباحثون نقدر الدور المحوري تعصيب متعاطفة في التنظيم لفسيولوجيا الأنسجة الدهنية. وبالتالي، من المهم وضع نهج عملية وسهلة تعصيب العصب الدهنية الوثيقة.
هنا، لدينا تقرير أسلوب أمثل لتلطيخ المشترك من الأوعية الدموية والألياف العصبية استناداً إلى أن البروتوكولات السابقة. بهذه الطريقة، يمكننا أن نحقق صور واضحة للأوعية الدموية والألياف العصبية دون ضجيج الخلفية. وعلاوة على ذلك، نحصل على قرار عالية بما يكفي لإجراء قياس كمي للكثافات مع برمجيات المصدر المفتوح. باستخدام هذا النهج الجديد، يمكننا بنجاح مقارنة بالهياكل وكثافة الأوعية الدموية والألياف العصبية في مختلف المستودعات الدهنية.
Protocol
Representative Results
Discussion
إعادة عرض الأنسجة الدهنية يرتبط ارتباطاً مباشرا بالتقلبات الأيض أثناء السمنة التنمية1،2. الأوعية وتعصيب متعاطفة كلاهما ضروري لعملية إعادة عرض ديناميكية2،12. ولذلك، وضع نهج المطبقة لتصور الأوعية الدموية الجديدة، فضلا عن الأل…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذه الدراسة المعهد الوطني للصحة (المعاهد الوطنية للصحة) منحة R01DK109001 (كانساس).
Materials
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 805-545-180 | Lot: 116969 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Lot: 121944 |
| Amira 6.0 | Thermo Fisher Scientific | Licensed software | |
| Angio tool | National Institutes of Health | Open source software https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home |
|
| Anti-mouse endomucin antibody | R&D research system | AF4666 | Lot: CAAS0115101 |
| Anti-tyrosine hydroxylase antibody | Pel Freez Biologicals | P40101-150 | Lot: aj01215y |
| Cover glasses high performance, D=0.17mm | Zeiss | 474030-9020-000 | |
| Cytoseal 280 | Thermo Fisher Scientific | 8311-4 | High-viscosity medium |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | |
| Paraformaldehyde,16% | TED PELLA | 170215 | |
| Press-to-Seal Silicone Isolator with Adhesive, eight wells, 9 mm diameter, 1.0 mm deep | INVITROGEN | P24744 | Silicone isolator |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36965 | Mounting medium |
| SEA BLOCK Blocking Buffer | Thermo Fisher Scientific | 37527X3 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | |
| Tissue Path IV Tissue Cassettes | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Triton Χ-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Generic term: octoxynol-9 |
| Tube rotator and rotisseries | VWR | 10136-084 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Generic term: Polysorbate 20 |
Referências
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Sun, K., Kusminski, C. M., Scherer, P. E. Adipose tissue remodeling and obesity. Journal of Clinical Investigations. 121 (6), 2094-2101 (2011).
- Sun, K., et al. Endotrophin triggers adipose tissue fibrosis and metabolic dysfunction. Nature Communication. 5, 3485 (2014).
- Zhao, Y., et al. Divergent functions of endotrophin on different cell populations in adipose tissue. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 311 (6), E952-E963 (2016).
- Zhao, Y., et al. Transient Overexpression of VEGF-A in Adipose Tissue Promotes Energy Expenditure via Activation of the Sympathetic Nervous System. Molecular and Cellular Biology. , (2018).
- Xue, Y., et al. Hypoxia-independent angiogenesis in adipose tissues during cold acclimation. Cell Metabolism. 9 (1), 99-109 (2009).
- Chen, S., et al. LncRNA TDRG1 enhances tumorigenicity in endometrial carcinoma by binding and targeting VEGF-A protein. BBA Molecular Basis of Disease. 1864 (9 Pt B), 3013-3021 (2018).
- Sun, K., et al. Dichotomous effects of VEGF-A on adipose tissue dysfunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (15), 5874-5879 (2012).
- During, M. J., et al. Adipose VEGF Links the White-to-Brown Fat Switch With Environmental, Genetic, and Pharmacological Stimuli in Male Mice. Endocrinology. 156 (6), 2059-2073 (2015).
- Elias, I., et al. Adipose tissue overexpression of vascular endothelial growth factor protects against diet-induced obesity and insulin resistance. Diabetes. 61 (7), 1801-1813 (2012).
- Sung, H. K., et al. Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis. Cell Metabolism. 17 (1), 61-72 (2013).
- Cao, Y. Angiogenesis and vascular functions in modulation of obesity, adipose metabolism, and insulin sensitivity. Cell Metabolism. 18 (4), 478-489 (2013).
- Sun, K., et al. Brown adipose tissue derived VEGF-A modulates cold tolerance and energy expenditure. Molecular Metabolism. 3 (4), 474-483 (2014).
- Zeng, W., et al. Sympathetic neuro-adipose connections mediate leptin-driven lipolysis. Cell. 163 (1), 84-94 (2015).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Berry, R., et al. Imaging of adipose tissue. Methods in Enzymology. 537, 47-73 (2014).
- Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue. Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).
- Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
- Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS One. 6 (11), e27385 (2011).
- An, Y. A., et al. Angiopoietin-2 in white adipose tissue improves metabolic homeostasis through enhanced angiogenesis. eLife. 6, (2017).
- Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
