Co färgning blodkärl och nervtrådar i fettvävnad
Summary
Nya blodkärl och sympatiska innervation spelar avgörande roller i fettvävnad ombyggnad. Finns dock fortfarande tekniska problem i visualisera och kvantitativt mäta fettvävnad. Här presenterar vi ett protokoll för att framgångsrikt etikett och kvantitativt jämföra tätheterna av blodkärl och nervtrådar i olika fettvävnad.
Abstract
Nyligen genomförda studier har belyst kritiska roll angiogenes och sympatiska innervation i fettvävnad ombyggnad under utvecklingen av fetma. Det är därför nödvändigt att utveckla en enkel och effektiv metod för att dokumentera de dynamiska förändringarna i fettvävnad. Här beskriver vi en modifierad Immunofluorescerande strategi som effektivt samarbete fläckar blodkärl och nervtrådar i fettvävnad. Vårt synsätt jämfört med traditionella och nyligen utvecklade metoder, och är relativt lätt att följa och effektivare i märkning blodkärl och nervtrådar med högre densiteter och mindre bakgrund. Dessutom tillåter högre upplösning bilder ytterligare oss att noggrant mäta området av fartyg, mängden förgreningar, och längden på fibrerna av programvara med öppen källkod. Som en demonstration med vår metod, visar vi att Brun fettvävnad (BAT) innehåller högre mängder av blodkärl och nervtrådar jämfört med vit fettväv (WAT). Vi ytterligare hitta att bland WATs, subkutan WAT (sWAT) har fler blodkärl och nervtrådar jämfört epididymal WAT (eWAT). Vår metod ger således ett användbart verktyg för att undersöka fettvävnad remodeling.
Introduction
Fettvävnaden har nyckel metabola och endokrina funktioner1. Det dynamiskt expanderar eller krymper svar på olika näringsämnen betonar2. Den aktiva vävnaden remodeling process består av flera fysiologiska vägar/steg inklusive angiogenes, fibros och utformningen av lokala inflammatoriska mikromiljö2,3,4. Vissa fysiska stimuli, såsom kallt exponering och motion, kan utlösa sympatisk aktivering, vilket i slutändan leder till nya blodkärl och sympatiska innervation i fettvävnad5,6. Dessa remodeling processer länkas tätt till systemisk metabola resultat inklusive insulinkänslighet, kännetecknet för typ 2-diabetes2. Visualisering av dessa patologiska förändringar är således mycket viktigt att förstå hela fettvävnad friska status.
Angiogenes är processen att nya blodkärl. Eftersom blodkärlen ge syre, näringsämnen, hormoner och tillväxtfaktorer för att vävnad, har angiogenes ansetts vara ett viktigt steg i fettvävnad remodeling, vilket har dokumenterats med olika tekniker6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. finns dock fortfarande frågor om upplösningen på bilderna, effektivitet immunfärgning och metoder för kvantifiering av fartyget densitet. Jämfört med nya blodkärl, har innervation i fettvävnad underskattats under lång tid. Nyligen, Zeng et al. 14 används avancerade intravital två-foton mikroskopi och visat att adipocyter är omgiven av lager av nervfibrer14. Sedan dess har forskare börjat uppskatta den centrala rollen som sympatisk innervation i regleringen av fettvävnad fysiologi. Det är därför viktigt att utveckla en enkel och praktisk strategi för dokumentet fett nerv innervation.
Vi rapporterar här, en optimerad metod för samtidig färgningen av blodkärl och nervtrådar baserat på våra tidigare protokoll. Med den här metoden kan vi uppnå tydliga bilder av blodkärl och nervtrådar utan bullriga bakgrund. Dessutom får vi en resolution som är tillräckligt hög för att utföra kvantitativa mätningen av densiteter med öppen källkod. Genom att använda detta nya tillvägagångssätt, kan vi framgångsrikt jämför strukturer och tätheter av blodkärl och nervtrådar i olika fett depåer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fettvävnad remodeling är direkt kopplad till metabola dysreglering under fetma utveckling1,2. Angiogenes och sympatiska innervation är båda viktiga för dynamisk remodeling process2,12. Utveckla en tillämplig metod för att visualisera den nya blodkärl samt nervfibrer är därför av stor betydelse. Tidigare metoder har rapporterats för att dokumentera angiogenes i fettvävnad. Vissa frågor kvarst…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av National Institute of Health (NIH) grant R01DK109001 (att K.S.).
Materials
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 805-545-180 | Lot: 116969 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Lot: 121944 |
| Amira 6.0 | Thermo Fisher Scientific | Licensed software | |
| Angio tool | National Institutes of Health | Open source software https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home |
|
| Anti-mouse endomucin antibody | R&D research system | AF4666 | Lot: CAAS0115101 |
| Anti-tyrosine hydroxylase antibody | Pel Freez Biologicals | P40101-150 | Lot: aj01215y |
| Cover glasses high performance, D=0.17mm | Zeiss | 474030-9020-000 | |
| Cytoseal 280 | Thermo Fisher Scientific | 8311-4 | High-viscosity medium |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | |
| Paraformaldehyde,16% | TED PELLA | 170215 | |
| Press-to-Seal Silicone Isolator with Adhesive, eight wells, 9 mm diameter, 1.0 mm deep | INVITROGEN | P24744 | Silicone isolator |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36965 | Mounting medium |
| SEA BLOCK Blocking Buffer | Thermo Fisher Scientific | 37527X3 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | |
| Tissue Path IV Tissue Cassettes | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Triton Χ-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Generic term: octoxynol-9 |
| Tube rotator and rotisseries | VWR | 10136-084 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Generic term: Polysorbate 20 |
Referências
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Sun, K., Kusminski, C. M., Scherer, P. E. Adipose tissue remodeling and obesity. Journal of Clinical Investigations. 121 (6), 2094-2101 (2011).
- Sun, K., et al. Endotrophin triggers adipose tissue fibrosis and metabolic dysfunction. Nature Communication. 5, 3485 (2014).
- Zhao, Y., et al. Divergent functions of endotrophin on different cell populations in adipose tissue. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 311 (6), E952-E963 (2016).
- Zhao, Y., et al. Transient Overexpression of VEGF-A in Adipose Tissue Promotes Energy Expenditure via Activation of the Sympathetic Nervous System. Molecular and Cellular Biology. , (2018).
- Xue, Y., et al. Hypoxia-independent angiogenesis in adipose tissues during cold acclimation. Cell Metabolism. 9 (1), 99-109 (2009).
- Chen, S., et al. LncRNA TDRG1 enhances tumorigenicity in endometrial carcinoma by binding and targeting VEGF-A protein. BBA Molecular Basis of Disease. 1864 (9 Pt B), 3013-3021 (2018).
- Sun, K., et al. Dichotomous effects of VEGF-A on adipose tissue dysfunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (15), 5874-5879 (2012).
- During, M. J., et al. Adipose VEGF Links the White-to-Brown Fat Switch With Environmental, Genetic, and Pharmacological Stimuli in Male Mice. Endocrinology. 156 (6), 2059-2073 (2015).
- Elias, I., et al. Adipose tissue overexpression of vascular endothelial growth factor protects against diet-induced obesity and insulin resistance. Diabetes. 61 (7), 1801-1813 (2012).
- Sung, H. K., et al. Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis. Cell Metabolism. 17 (1), 61-72 (2013).
- Cao, Y. Angiogenesis and vascular functions in modulation of obesity, adipose metabolism, and insulin sensitivity. Cell Metabolism. 18 (4), 478-489 (2013).
- Sun, K., et al. Brown adipose tissue derived VEGF-A modulates cold tolerance and energy expenditure. Molecular Metabolism. 3 (4), 474-483 (2014).
- Zeng, W., et al. Sympathetic neuro-adipose connections mediate leptin-driven lipolysis. Cell. 163 (1), 84-94 (2015).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Berry, R., et al. Imaging of adipose tissue. Methods in Enzymology. 537, 47-73 (2014).
- Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue. Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).
- Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
- Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS One. 6 (11), e27385 (2011).
- An, Y. A., et al. Angiopoietin-2 in white adipose tissue improves metabolic homeostasis through enhanced angiogenesis. eLife. 6, (2017).
- Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
