Co farvning blodkar og Nerve fibre i fedtvæv
Summary
Nye blodkar dannes og sympatiske innervation spille centrale roller i fedtvæv remodellering. Der er dog stadig tekniske problemer i visualisering og kvantitativ måling af fedtvæv. Her præsenterer vi en protokol for at med held etiket og kvantitativt sammenligne tætheder af blodkar og nerve fibre i forskellige fedtvæv.
Abstract
Nylige undersøgelser har fremhævet den afgørende rolle af angiogenese og sympatiske innervation i fedtvæv remodeling under udviklingen af fedme. Det er derfor nødvendigt at udvikle en nem og effektiv metode til at dokumentere de dynamiske ændringer i fedtvæv. Her, beskriver vi en modificeret immunfluorescent tilgang, der effektivt Co pletter blodkar og nerve fibre i fedtvæv. Sammenlignet med traditionelle og nyligt udviklede metoder, er vores tilgang relativt let at følge og mere effektiv i mærkning af blodkar og nerve fibre med højere tætheder og mindre baggrund. Desuden, den højere opløsning af billederne yderligere tillader os at præcist at måle området af skibe, mængden af filialer, og længden af fibrene af open source-software. Som en demonstration ved hjælp af vores metode, viser vi, at brunt fedtvæv (BAT) indeholder større mængder af blodkar og nerve fibre i forhold til hvidt fedtvæv (WAT). Vi yderligere find, blandt for WATs subkutane WAT (sWAT) har flere blodkar og nerve fibre i forhold til epididymis WAT (eWAT). Vores metode giver således et nyttigt redskab til at undersøge fedtvæv remodellering.
Introduction
Fedtvæv er nøglen metaboliske og endokrine funktioner1. Det dynamisk udvides eller formindskes i svar på forskellige næringsstoffer understreger2. Den aktive væv remodellering proces består af flere fysiologisk stier/trinene herunder angiogenese, fibrose og formning af lokale inflammatoriske microenvironments2,3,4. Nogle fysiske stimuli, såsom koldt eksponering og motion, kan udløse sympatisk aktivering, hvilket i sidste ende fører til nye blodkar dannes og sympatiske innervation i fedtvæv5,6. Disse remodeling processer er knyttet tæt til systemisk metabolisk resultater herunder insulinfølsomhed, kendetegnende for type 2 diabetes2. Visualisering af disse patologiske ændringer er således meget vigtigt at forstå hele fedtvæv sund status.
Angiogenese er processen med nye blodkar dannes. Da blodkar, der leverer ilt, næringsstoffer, hormoner og vækstfaktorer til væv, angiogenese har været betragtet som et vigtigt skridt i fedtvæv remodeling, som er blevet dokumenteret med forskellige teknikker6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. men der er stadig spørgsmål om opløsning af billederne, effektiviteten af immunfarvning og metoder til kvantificering af fartøjet tæthed. I forhold til nye blodkar dannes, har været undervurderet innervation i fedtvæv i lang tid. For nylig, Zeng mfl. 14 brugt avanceret intravital to-foton mikroskopi og demonstreret at adipocytter er omgivet af lag af nervefibre14. Siden da, er forskere begyndt at sætte pris på den afgørende rolle af sympatiske innervation i regulering af fedtvæv fysiologi. Derfor er udvikle en nem og praktisk tilgang til dokument adipøst nerve innervation vigtigt.
Her rapporterer vi en optimeret metode for Co farvning af blodkar og nerve fibre baseret på vores tidligere protokoller. Med denne metode, kan vi opnå tydelige billeder af blodkar og nerve fibre uden støjende baggrund. Desuden, vi får en beslutning, der er høj nok til at udføre kvantitativ måling af tætheder med open source software. Ved hjælp af denne nye tilgang, kan vi med held sammenligne strukturer og tætheder af blodkar og nerve fibre i forskellige fedt depoter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fedtvæv remodellering er direkte knyttet til metaboliske dysregulering under fedme udvikling1,2. Angiogenese og sympatiske innervation er både væsentlige for den dynamiske remodeling proces2,12. Derfor udvikle en relevant tilgang til at visualisere den nye blodkar samt nerve fibre er af stor betydning. Tidligere metoder er blevet rapporteret til at dokumentere angiogenese i fedtvæv. Nogle spørgsmål …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af National Institute of Health (NIH) grant R01DK109001 (til K.S.).
Materials
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 805-545-180 | Lot: 116969 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-605-152 | Lot: 121944 |
| Amira 6.0 | Thermo Fisher Scientific | Licensed software | |
| Angio tool | National Institutes of Health | Open source software https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home |
|
| Anti-mouse endomucin antibody | R&D research system | AF4666 | Lot: CAAS0115101 |
| Anti-tyrosine hydroxylase antibody | Pel Freez Biologicals | P40101-150 | Lot: aj01215y |
| Cover glasses high performance, D=0.17mm | Zeiss | 474030-9020-000 | |
| Cytoseal 280 | Thermo Fisher Scientific | 8311-4 | High-viscosity medium |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | |
| Paraformaldehyde,16% | TED PELLA | 170215 | |
| Press-to-Seal Silicone Isolator with Adhesive, eight wells, 9 mm diameter, 1.0 mm deep | INVITROGEN | P24744 | Silicone isolator |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36965 | Mounting medium |
| SEA BLOCK Blocking Buffer | Thermo Fisher Scientific | 37527X3 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | |
| Tissue Path IV Tissue Cassettes | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Triton Χ-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Generic term: octoxynol-9 |
| Tube rotator and rotisseries | VWR | 10136-084 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Generic term: Polysorbate 20 |
Referências
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Sun, K., Kusminski, C. M., Scherer, P. E. Adipose tissue remodeling and obesity. Journal of Clinical Investigations. 121 (6), 2094-2101 (2011).
- Sun, K., et al. Endotrophin triggers adipose tissue fibrosis and metabolic dysfunction. Nature Communication. 5, 3485 (2014).
- Zhao, Y., et al. Divergent functions of endotrophin on different cell populations in adipose tissue. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 311 (6), E952-E963 (2016).
- Zhao, Y., et al. Transient Overexpression of VEGF-A in Adipose Tissue Promotes Energy Expenditure via Activation of the Sympathetic Nervous System. Molecular and Cellular Biology. , (2018).
- Xue, Y., et al. Hypoxia-independent angiogenesis in adipose tissues during cold acclimation. Cell Metabolism. 9 (1), 99-109 (2009).
- Chen, S., et al. LncRNA TDRG1 enhances tumorigenicity in endometrial carcinoma by binding and targeting VEGF-A protein. BBA Molecular Basis of Disease. 1864 (9 Pt B), 3013-3021 (2018).
- Sun, K., et al. Dichotomous effects of VEGF-A on adipose tissue dysfunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (15), 5874-5879 (2012).
- During, M. J., et al. Adipose VEGF Links the White-to-Brown Fat Switch With Environmental, Genetic, and Pharmacological Stimuli in Male Mice. Endocrinology. 156 (6), 2059-2073 (2015).
- Elias, I., et al. Adipose tissue overexpression of vascular endothelial growth factor protects against diet-induced obesity and insulin resistance. Diabetes. 61 (7), 1801-1813 (2012).
- Sung, H. K., et al. Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis. Cell Metabolism. 17 (1), 61-72 (2013).
- Cao, Y. Angiogenesis and vascular functions in modulation of obesity, adipose metabolism, and insulin sensitivity. Cell Metabolism. 18 (4), 478-489 (2013).
- Sun, K., et al. Brown adipose tissue derived VEGF-A modulates cold tolerance and energy expenditure. Molecular Metabolism. 3 (4), 474-483 (2014).
- Zeng, W., et al. Sympathetic neuro-adipose connections mediate leptin-driven lipolysis. Cell. 163 (1), 84-94 (2015).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Berry, R., et al. Imaging of adipose tissue. Methods in Enzymology. 537, 47-73 (2014).
- Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue. Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).
- Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
- Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS One. 6 (11), e27385 (2011).
- An, Y. A., et al. Angiopoietin-2 in white adipose tissue improves metabolic homeostasis through enhanced angiogenesis. eLife. 6, (2017).
- Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
