이류성 에 대한 착상 전 유전자 검사를위한 반도체 시퀀싱
Summary
여기서는 짧은 처리 시간, 낮은 비용 및 높은 처리량의 장점을 가진 이수성 (PGT-A)에 대한 착상 전 유전자 검사를위한 반도체 염기서열 분석 방법을 소개합니다.
Abstract
염색체 이수성, 배아 발달 체포, 이식 실패, 또는 임신 손실로 이끌어 내는 주요 원인의 한개는, 인간 적인 태아에서 잘 문서화되었습니다. 이수성 (PGT-A)에 대한 착상 전 유전자 검사는 배아의 염색체 이상을 검출하여 생식 결과를 크게 향상시키는 유전자 검사입니다. 차세대 염기서열 분석(NGS)은 유전자 분석을 위한 높은 처리량과 비용 효율적인 접근 방식을 제공하며 PGT-A에서 임상 적용가능성을 보여주었습니다. 여기서, 우리는 배아에서 이수성 의 스크리닝을 위한 신속하고 저비용 반도체 염기서열 NGS 방법을 제시한다. 워크플로우의 첫 번째 단계는 생검된 배아 시편의 전체 게놈 증폭(WGA)이며, 그 다음에는 시퀀싱 라이브러리의 시딩 및 반도체 시퀀싱 시스템의 후속 시퀀싱이 뒤따릅니다. 일반적으로 PGT-A 애플리케이션의 경우 각 칩에 24개의 샘플을 로드하고 시퀀싱하여 150개의 기본 쌍의 평균 판독 길이에서 60-8000만 개의 판독을 생성할 수 있습니다. 이 방법은 시퀀싱 라이브러리의 템플릿 증폭 및 보강을 수행하기 위한 정교한 프로토콜을 제공하여 PGT-A 감지를 재현 가능, 높은 처리량, 비용 효율적이고 시간 절약으로 만듭니다. 이 반도체 시퀀서의 실행 시간은 2-4 시간이며 샘플 수신에서 보고서 발행까지 소요 시간이 5 일로 단축됩니다. 이 모든 이점은 이 분석법을 배아에서 염색체 이수성을 검출하고, 따라서 PGT-A에 있는 그것의 넓은 응용을 촉진하는 이상적인 방법합니다.
Introduction
보조 생식에 있는 전송을 위한 일반적인 염색체 사본 수 (euploid)를 가진 좋은 질 실행 가능한 태아를 선택하는 것은 임신 결과를 향상하는 것을 돕습니다. 전통적으로, 잘 확립 된 형태 학적 등급 시스템은 쉽게 가용성과 비 침습적 특성으로 인해 배아 평가에 널리 사용됩니다. 그러나, 형태학적 평가는 배아 질1 및 이식 잠재력2에대한 제한된 정보만 제공할 수 있는 것으로 나타났다. 한 가지 근본적인 이유는 배아의 염색체 조성을 평가할 수 없기 때문입니다.
염색체 이수성 (염색체의 비정상적인 카피 수)은 배아 발달 체포, 이식 실패 또는 임신 손실로 이어지는 주요 원인 중 하나입니다. 이수성의 발생은 인간 배아에서 잘 문서화되어 있으며, 골반포 낭포제3,4 및 50 %-60 %에서 60 %를차지합니다5. 이는, 어느 정도, 체외 수정 (IVF) 치료의 임신 율을 개선에 병목 현상에 기여하고있다, 이는 약에서 유지하고있다35%-40% 6,7. 그러므로, 전송을 위한 euploid 태아를 선택하는 것은 임신 결과 향상을 위해 유익할 것으로 믿어집니다. 이를 위해, 이수성 (PGT-A)에 대한 착상 전 유전자 검사는 유전 적 접근을 사용하여 배아 생존가능성을 조사하기 위해 추가로 개발되었다. PGT-A의 중요한 역할을 지원하는 무작위 통제 실험 및 코호트 연구의 수가 증가하고 있습니다. PGT-A의 적용은 유산율을 감소시키고 임상 임신율과 이식율 8,진행 중인 임신율 및 출산율9를증가시키는 것으로 입증되었다.
역사적으로, PGT-A에서 다양한 방법이 적용되어 왔으며, 이러한 경우 형광은 체자형화(FISH), 비교 게놈 혼성화(CGH), 어레이-CGH, 및 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)-마이크로어레이이다. 이전 연구는 물고기에 의한 분열 단계 배아에 대한 PGT-A가 59273array-CGH 또는 를 사용하여 해당 배반포의 포괄적 인 염색체 스크리닝 (CCS)에 의해 얻은 것과 제대로 일치하지 않는 결과를 산출한다는 것을 나타났습니다. SNP-마이크로어레이5927310. 이러한 불일치는 개발11동안 염색체 분리 오차의 염색체 모자이크, FISH 기술 적 유물 또는 배아 자기 교정에 기인할 수 있다. 어레이-CGH 또는 SNP-마이크로어레이와 같은 어레이 기반 PGT-A에 대한 배반포 트로프토더(TE) 생검을 사용하는 것이 배아10,12에서염색체 불균형을 식별하는 데 효과적이라는 것이 널리 인식되고 있다. 최근, 단세포 차세대 염기서열 분석(NGS)은 유전자 분석을 위한 높은 처리량과 비용 효율적인 접근법을 제공하며 PGT-A13,14,15에서임상 적 적용성을 보이고 있으며, 이는 현재 사용 가능한 방법에 대한 유망한 대안.
여기에서, 우리는 인간 배아에서 이수성의 검열을 위한 빠르고, 견고하고, 저가의 반도체 염기서열 NGS 방법을 제시합니다. 워크플로우의 첫 번째 단계는 생검된 배아 시편의 전체 게놈 증폭(WGA)이며, 단일 세포 WGA 키트를 사용한 다음 시퀀싱 라이브러리를 시빙하고 반도체 시퀀싱 시스템에서 후속 시퀀싱을 수행합니다.
DNA 가닥 합성 시 각 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트 혼입에서 방출되는 H+ 이온을 검출함으로써, 시스템은 반도체 소자로부터 포착된 화학적 신호(pH 변화)를 디지털 데이터를 직접 전달한다. , 이는 DNA 서열 정보로 더 해석된다. 고가의 광학 검출 및 복잡한 시퀀싱 반응에 대한 요구 사항을 제거한 이 간단한 시퀀싱 화학은 총 시약 비용을 줄이고 시퀀싱 실행 시간을 2-4시간16시간으로단축합니다. 더 중요한 것은 제조업체의 성능 사양에 따라 반도체 시퀀싱 플랫폼은 실행당 최대 15GB 의 시퀀싱 데이터(라이브러리 품질에 따라 다름)를 생성할 수 있으며, 이는 다른 시퀀서보다 훨씬 높다는 것입니다. 약 3-4GB 데이터(2 x 75bp 읽기 길이)만 생성합니다17. PGT-A의 임상 적용에서 이 플랫폼은 칩당 24개의 샘플을 생성하여 최대 8,000만 개의 읽기17개 및 각 샘플의 최소 100만 개의 고유 판독을 달성할 수 있습니다. 판독 깊이는 각 샘플이 적어도 0.05x 전체 게놈 커버리지를 가지고 있는지 확인할 수 있습니다. 이 플랫폼의 위의 장점은 이상적인 스크리닝 방법을 만들어 PGT-A18의광범위한 응용 프로그램을 용이하게합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
다른 시퀀싱 화학과는 달리, 여기에 설명된 시퀀서는 뉴클레오티드 검출을 위해 반도체를 사용합니다. 칩 자체는 양성자 프로그램의 2−4 시간 시퀀싱 시간을 가능하게 하는 폴리머라제 구동 염기 통합17에의해 수소 이온을 검출하는 전자 장치입니다. 게다가, 칩은 다른 시퀀서 공급자에 의한 유동 세포 시퀀싱 화학과 다른 하나의 표적 분자의 국소화를 허용하는 마이크로웰 칩?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 홍콩의 일반 연구 기금 (참조 번호 14162417) 중국 국립 자연 과학 재단 (참조 번호 81860272), 광시 지방 과학 기술 재단의 주요 연구 계획에 의해 지원되었다 (참조 번호) AB16380219), 그리고 중국에서 중국 박사 후 과학 재단 보조금 (참조 번호 2018M630993).
Materials
| PCR tubes, 0.2 mL | Axygen | PCR-02D-C | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
| PBS, pH 7.4, Ca2+ and Mg2+ free | ThermoFisher | 10010023 | |
| 1.0 M NaOH (1.0N) solution | SIGMA-ALDRICH | S2567 | For Melt-off solution. Molecular grade |
| Eppendorf LoBind Tubes, 1.5 mL | Fisher Scientific | 13-698-791 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| ELGA PURELAB Flex 3 Water Purification System or Equivalent 18 MΩ water system |
ThermoFisher | 4474524 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| PicoPLEX WGA Amplification buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| PicoPLEX WGA Amplification enzyme | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Ion OneTouch Amplification Plate | In kit: Ion OneTouch 2 Supplies (Part No. A26367). Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Ion PI Annealing Buffer | |||
| MyOne Beads Capture Solution | |||
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939AA | |
| Ion OneTouch Breaking Solution (black cap) | In kit: Ion PI Hi‑Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | ThermoFisher | 65001 | |
| PicoPLEX WGA Cell extraction buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-00. |
| PicoPLEX WGA Cell extraction enzyme | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Ion PI Chip Kit v3 | ThermoFisher | A26771 | |
| Ion Chip Minifuge, 230 V | ThermoFisher | 4479673 | |
| Ion PI dATP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI dCTP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI dGTP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| ThermoQ–Temperature Dry Bath | TAMAR | HB-T2-A | |
| NEBNext dsDNA Fragmentase | New England Biolabs | M0348L | |
| NEBNext dsDNA Fragmentase | New England Biolabs | M0348L | |
| Ion PI dTTP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion OneTouch 2 Instrument | ThermoFisher | INS1005527 | ThermoFisher Catalog number: 4474778. |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| Ion One Touch ES | ThermoFisher | 8441-22 | ThermoFisher Catalog number: 4469495. Extended kit component in Sheet 5 |
| Ethanol | SIGMA-ALDRICH | 51976 | This can be replaced by any brand's molecular grade absolute ethanol. |
| PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-01. |
| PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-02. |
| Qubit 3.0 Fluorometer | ThermoFisher | Q33216 | This model has been replaced by Qubit 4 Fluorometer, Catalog number: Q33226. |
| Qubit ds DNA HS Assay kit | ThermoFisher | M2002-02 | |
| Qubit Assay Tubes | ThermoFisher | Q32856 | |
| Ion PI Foaming Solution | ThermoFisher | A26772 | |
| Index for barcoding of libraries | BaseCare | this is a in-house prepared index. Users can buy commercial product from ThermoFisher Ion Xpress Barcode Adapters Kits (Cat. No. 4474517) | |
| Ion PI Loading Buffer | ThermoFisher | A26772 | |
| Solid(TM) Buffer Kit-1X Low TE Buffer | ThermoFisher | 4389764 | |
| Agencour AMPure XP Kit | Beckman Coulter | A63880 | |
| DynaMag-2 magnet (magnetic rack) | ThermoFisher | 12321D | |
| Ion PI Master Mix PCR buffer | |||
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Micro 17 | 75002430 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| Nuclease-free water | ThermoFisher | AM9922 | This can be replaced by other brand. |
| PicoPLEX WGA Nuclease-free water | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Ion OneTouch Oil bottle | Ion PI Hi‑Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | Extended kit component in Sheet 3 |
| double-strand DNA standard | This is a in-house prepared DNA standard for calibration of Qubit before quantification of library. | ||
| PicoPLEX WGA Preamplification buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| PicoPLEX WGA Preamplification enzyme | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Library Amplification Primer Mix | ThermoFisher | 4471252 | Extended kit component in Sheet 3 |
| Ion OneTouch Reaction Filter | Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Recovery Router | Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Recovery Tubes | Extended kit component in Sheet 5 | ||
| ISP Resuspension Solution | |||
| Ion Proton | ThermoFisher | DA8600 | This model is imported by Da An Gene Co.,LTD. of Sun Yat-Sen University from ThermoFisher and has been certified by China Food and Drug Administration for clinical application. The catalog number in ThermoFisher is 4476610. |
| Ion PI Hi‑Q Sequencing Polymerase | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI Sequencing Primer | |||
| server for sequencer | Lenovo | T260 | |
| Ion PI Sphere Particles | |||
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | ThermoFisher | 4471252 | |
| Nalgene 25mm Syringe Filters | ThermoFisher | 724-2045 | Pore size: 0.45μm. Specifically for aqueous fluids. |
| Ion PI Hi‑Q W2 Solution | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI 1X W3 Solution | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion OneTouch Wash Solution C1 | |||
| The Ion PGM Hi‑Q View Sequencing Kit | ThermoFisher | A30044 | Extended kit component in Sheet 2 |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | Extended kit component in Sheet 3 |
| Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit (1 sequencing run per initialization) | ThermoFisher | A26772 | Extended kit component in Sheet 4 |
| Ion PI Hi‑Q OT2 200 Kit | ThermoFisher | A26434 | Extended kit component in Sheet 5 |
Referências
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