Secuenciación de semiconductores para pruebas genéticas preimplantaciones para la aneuploidía
Summary
Aquí, introducimos un método de secuenciación de semiconductores para pruebas genéticas preimplantacionales para la aneuploidía (PGT-A) con las ventajas de un tiempo de respuesta corto, bajo costo y alto rendimiento.
Abstract
El aneuploidía cromosómico, una de las principales causas que conducen a la detención del desarrollo embrionario, el fracaso de la implantación o la pérdida del embarazo, ha sido bien documentado en embriones humanos. Las pruebas genéticas preimplantacionales para la aneuploidía (PGT-A) son una prueba genética que mejora significativamente los resultados reproductivos mediante la detección de anomalías cromosómicas de embriones. La secuenciación de próxima generación (NGS) proporciona un enfoque de alto rendimiento y rentable para el análisis genético y ha demostrado aplicabilidad clínica en PGT-A. Aquí, presentamos un método NGS basado en secuenciación de semiconductores rápido y de bajo costo para el cribado de la aneuploidía en embriones. El primer paso del flujo de trabajo es la amplificación completa del genoma (WGA) del espécimen embrionario biopsiado, seguido de la construcción de la biblioteca de secuenciación, y la secuenciación posterior en el sistema de secuenciación de semiconductores. Generalmente, para una aplicación PGT-A, se pueden cargar y secuenciar 24 muestras en cada chip generando 60 a 80 millones de lecturas con una longitud de lectura promedio de 150 pares base. El método proporciona un protocolo refinado para realizar la amplificación de plantillas y el enriquecimiento de la biblioteca de secuenciación, haciendo que la detección PGT-A sea reproducible, de alto rendimiento, rentable y de ahorro de tiempo. El tiempo de funcionamiento de este secuenciador de semiconductores es de sólo 2 a 4 horas, lo que acorta el tiempo de respuesta desde la recepción de muestras hasta la emisión de informes en 5 días. Todas estas ventajas hacen de este ensayo un método ideal para detectar aneuploidias cromosómicas de embriones y así, facilitar su amplia aplicación en PGT-A.
Introduction
La elección de embriones viables de buena calidad con números normales de copia cromosómica (euploide) para la transferencia en reproducción asistida ayuda a mejorar los resultados del embarazo. Tradicionalmente, el sistema de clasificación morfológica bien establecido es ampliamente utilizado para la evaluación de embriones debido a su fácil disponibilidad y naturaleza no invasiva. Sin embargo, se ha demostrado que la evaluación morfológica sólo puede proporcionar información limitada sobre la calidad del embrión1 y el potencial de implantación2. Una razón fundamental es su incapacidad para evaluar la composición cromosómica de los embriones.
La aneuploidía cromosómica (número anormal de cromosomas) es una de las principales causas que conducen a la detención del desarrollo embrionario, el fallo de implantación o la pérdida del embarazo. La aparición de aneuploidía ha sido bien documentada en embriones humanos, representando entre el 60% y el 70% en embriones en etapa de escisión3,4 y 50%-60% en blastocistos5. Esto, en cierta medida, ha contribuido al cuello de botella en la mejora de la tasa de embarazo del tratamiento de fertilización in vitro (FIV), que se ha mantenido en torno al 35%-40%6,7. Por lo tanto, se cree que la selección de embriones euploides para la transferencia es beneficioso para mejorar los resultados del embarazo. Con este fin, se han desarrollado más a fondo pruebas genéticas preimplantacionales para la aneuploidía (PGT-A) para investigar la viabilidad de los embriones mediante enfoques genéticos. Cada vez hay más ensayos controlados aleatorios y estudios de cohortes que apoyan el papel crucial de la PGT-A. Se ha demostrado que la aplicación de PGT-A disminuye la tasa de abortoespontáneo y aumenta la tasa de embarazo clínico y la tasa de implantación 8, la tasa de embarazo en curso y la tasa de nacimientos vivos9.
Históricamente, se han aplicado diferentes métodos en PGT-A, como la hibridación in situ por fluorescencia (FISH), la hibridación genómica comparativa (CGH), la matriz-CGH y el polimorfismo nucleótido único (SNP)-microarray. Estudios anteriores han indicado que PGT-A para embriones en etapa de escisión por FISH produce resultados que son poco consistentes con los obtenidos por cribado cromosómico integral (CCS) de los blastocistos correspondientes utilizando 59273array-CGH o SNP-microarray5927310. Estas discrepancias pueden atribuirse al mosaico cromosómico, a los artefactos técnicos FISH o a la autocorrección embrionaria de los errores de segregación cromosómica durante el desarrollo11. Se ha reconocido ampliamente que el uso de biopsias de tropoctodem (TE) de blastoctodermo (TE) para PGT-A basado en matrices, como la matriz-CGH o el microarray SNP, es eficaz para identificar el desequilibrio cromosómico en embriones10,12. Recientemente, la secuenciación de próxima generación de una sola célula (NGS) proporciona un enfoque de alto rendimiento y rentable para el análisis genético y ha demostrado aplicabilidad clínica en PGT-A13,14,15, lo que la convierte en un alternativa prometedora a los métodos actualmente disponibles.
Aquí, presentamos un método NGS basado en secuenciación de semiconductores rápido, robusto y de bajo costo para el cribado de la aneuploidía en embriones humanos. El primer paso del flujo de trabajo es la amplificación del genoma completo (WGA) de la muestra de embrión biopsiado, utilizando un kit WGA de una sola célula, seguido de la construcción de la biblioteca de secuenciación, y la secuenciación posterior en el sistema de secuenciación de semiconductores.
Mediante la detección de los iones H+ que se liberan de cada incorporación de trifosfato de desoxirribonucleósido durante la síntesis de la cadena de ADN, el sistema transfiere las señales químicas (cambio de pH) capturadas por los elementos semiconductores a datos digitales directos , que se interpretan más detalladamente en la información de la secuencia de ADN. Eliminando el requisito de detección óptica costosa y reacciones de secuenciación complejas, esta química de secuenciación simple reduce el costo total del reactivo y acorta el tiempo de funcionamiento de la secuenciación en 2 x 4 horas16. Más importante aún, sobre la base de las especificaciones de rendimiento del fabricante, la plataforma de secuenciación de semiconductores puede generar hasta 15 GB de datos de secuenciación (depende de la calidad de la biblioteca) por carrera, que es significativamente mayor que algunos de los otros secuenciadores produciendo sólo alrededor de 3 x 4 GB de datos (con 2 x 75 bp de longitud de lectura)17. En las aplicaciones clínicas de PGT-A, esta plataforma puede lograr 24 muestras por chip generando hasta 80 millones de lecturas17 y al menos un millón de lecturas únicas de cada muestra. La profundidad de lectura puede garantizar que cada muestra tenga al menos una cobertura completa del genoma de 0,05 x. Las ventajas anteriores de esta plataforma la convierten en un método de cribado ideal y, por lo tanto, facilitan sus amplias aplicaciones en PGT-A18.
Protocol
Representative Results
Discussion
A diferencia de otras químicas de secuenciación, el secuenciador descrito aquí utiliza semiconductores para la detección de nucleótidos. El chip en sí es un dispositivo electrónico que detecta iones de hidrógeno por la incorporación de base impulsada por la polimerasa17,lo que permite un tiempo de secuenciación de 2 x 4 horas del programa Proton. Además, el chip es un chip de micropozo que permite la localización de una molécula de destino, que es diferente de la química de secuencia…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por el Fondo General de Investigación (Ref No 14162417) de Hong Kong, la National Natural Science Foundation of China (Ref No 81860272), el Plan de Investigación Principal de la Fundación Provincial de Ciencia y Tecnología de Guangxi (Ref No. AB16380219), y la Beca de la Fundación de Ciencia Postdoctoral de China (Ref No. 2018M630993) de China.
Materials
| PCR tubes, 0.2 mL | Axygen | PCR-02D-C | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
| PBS, pH 7.4, Ca2+ and Mg2+ free | ThermoFisher | 10010023 | |
| 1.0 M NaOH (1.0N) solution | SIGMA-ALDRICH | S2567 | For Melt-off solution. Molecular grade |
| Eppendorf LoBind Tubes, 1.5 mL | Fisher Scientific | 13-698-791 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| ELGA PURELAB Flex 3 Water Purification System or Equivalent 18 MΩ water system |
ThermoFisher | 4474524 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| PicoPLEX WGA Amplification buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| PicoPLEX WGA Amplification enzyme | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Ion OneTouch Amplification Plate | In kit: Ion OneTouch 2 Supplies (Part No. A26367). Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Ion PI Annealing Buffer | |||
| MyOne Beads Capture Solution | |||
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939AA | |
| Ion OneTouch Breaking Solution (black cap) | In kit: Ion PI Hi‑Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | ThermoFisher | 65001 | |
| PicoPLEX WGA Cell extraction buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-00. |
| PicoPLEX WGA Cell extraction enzyme | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Ion PI Chip Kit v3 | ThermoFisher | A26771 | |
| Ion Chip Minifuge, 230 V | ThermoFisher | 4479673 | |
| Ion PI dATP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI dCTP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI dGTP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| ThermoQ–Temperature Dry Bath | TAMAR | HB-T2-A | |
| NEBNext dsDNA Fragmentase | New England Biolabs | M0348L | |
| NEBNext dsDNA Fragmentase | New England Biolabs | M0348L | |
| Ion PI dTTP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion OneTouch 2 Instrument | ThermoFisher | INS1005527 | ThermoFisher Catalog number: 4474778. |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| Ion One Touch ES | ThermoFisher | 8441-22 | ThermoFisher Catalog number: 4469495. Extended kit component in Sheet 5 |
| Ethanol | SIGMA-ALDRICH | 51976 | This can be replaced by any brand's molecular grade absolute ethanol. |
| PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-01. |
| PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-02. |
| Qubit 3.0 Fluorometer | ThermoFisher | Q33216 | This model has been replaced by Qubit 4 Fluorometer, Catalog number: Q33226. |
| Qubit ds DNA HS Assay kit | ThermoFisher | M2002-02 | |
| Qubit Assay Tubes | ThermoFisher | Q32856 | |
| Ion PI Foaming Solution | ThermoFisher | A26772 | |
| Index for barcoding of libraries | BaseCare | this is a in-house prepared index. Users can buy commercial product from ThermoFisher Ion Xpress Barcode Adapters Kits (Cat. No. 4474517) | |
| Ion PI Loading Buffer | ThermoFisher | A26772 | |
| Solid(TM) Buffer Kit-1X Low TE Buffer | ThermoFisher | 4389764 | |
| Agencour AMPure XP Kit | Beckman Coulter | A63880 | |
| DynaMag-2 magnet (magnetic rack) | ThermoFisher | 12321D | |
| Ion PI Master Mix PCR buffer | |||
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Micro 17 | 75002430 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| Nuclease-free water | ThermoFisher | AM9922 | This can be replaced by other brand. |
| PicoPLEX WGA Nuclease-free water | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Ion OneTouch Oil bottle | Ion PI Hi‑Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | Extended kit component in Sheet 3 |
| double-strand DNA standard | This is a in-house prepared DNA standard for calibration of Qubit before quantification of library. | ||
| PicoPLEX WGA Preamplification buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| PicoPLEX WGA Preamplification enzyme | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Library Amplification Primer Mix | ThermoFisher | 4471252 | Extended kit component in Sheet 3 |
| Ion OneTouch Reaction Filter | Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Recovery Router | Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Recovery Tubes | Extended kit component in Sheet 5 | ||
| ISP Resuspension Solution | |||
| Ion Proton | ThermoFisher | DA8600 | This model is imported by Da An Gene Co.,LTD. of Sun Yat-Sen University from ThermoFisher and has been certified by China Food and Drug Administration for clinical application. The catalog number in ThermoFisher is 4476610. |
| Ion PI Hi‑Q Sequencing Polymerase | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI Sequencing Primer | |||
| server for sequencer | Lenovo | T260 | |
| Ion PI Sphere Particles | |||
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | ThermoFisher | 4471252 | |
| Nalgene 25mm Syringe Filters | ThermoFisher | 724-2045 | Pore size: 0.45μm. Specifically for aqueous fluids. |
| Ion PI Hi‑Q W2 Solution | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI 1X W3 Solution | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion OneTouch Wash Solution C1 | |||
| The Ion PGM Hi‑Q View Sequencing Kit | ThermoFisher | A30044 | Extended kit component in Sheet 2 |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | Extended kit component in Sheet 3 |
| Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit (1 sequencing run per initialization) | ThermoFisher | A26772 | Extended kit component in Sheet 4 |
| Ion PI Hi‑Q OT2 200 Kit | ThermoFisher | A26434 | Extended kit component in Sheet 5 |
Referências
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