Sequenciamento de semicondutores para teste genético pré-implante para aneuploidia
Summary
Aqui, apresentamos um método de sequenciamento de semicondutores para teste genético pré-implante para aneuploidia (PGT-A) com as vantagens de tempo de resposta curto, baixo custo e alta taxa de transferência.
Abstract
O aneuploidy cromossomático, uma das causas principais que conduzem à apreensão embrionária do desenvolvimento, à falha da implantação, ou à perda da gravidez, foi poço-documentado em embriões humanos. O teste genético pré-implante para aneuploidia (PGT-A) é um teste genético que melhora significativamente os desfechos reprodutivos detectando anormalidades cromossômicas de embriões. O sequenciamento de próxima geração (NGS) fornece uma abordagem de alta taxa de transferência e custo-benefício para análise genética e demonstrou aplicabilidade clínica na PGT-A. Aqui, apresentamos um método de NGS baseado em sequenciamento de semicondutores rápido e de baixo custo para a triagem de aneuploidia em embriões. A primeira etapa do fluxo de trabalho é a amplificação total do genoma (WGA) do espécime biópsia do embrião, seguida pela construção da biblioteca de sequenciamento, e seqüenciamento subseqüente no sistema de sequenciamento de semicondutores. Geralmente, para um aplicativo PGT-A, 24 amostras podem ser carregadas e sequenciadas em cada chip gerando 60 − 80 milhões de leituras em um comprimento médio de leitura de 150 pares de base. O método fornece um protocolo refinado para executar a amplificação do modelo e o enriquecimento da biblioteca de sequenciamento, tornando a detecção de PGT-A reprodutível, alta taxa de transferência, econômica e timesaving. O tempo de funcionamento deste sequenciador de semicondutores é de apenas 2 − 4 horas, encurtando o tempo de resposta de receber amostras para emitir relatórios em 5 dias. Todas estas vantagens fazem deste ensaio um método ideal para detectar aneuploidias cromossomáticos de embriões e, assim, facilitar a sua ampla aplicação em PGT-A.
Introduction
A escolha de embriões viáveis de boa qualidade com números normais de cópia cromossômica (euploid) para transferência na reprodução assistida ajuda a melhorar os resultados da gravidez. Tradicionalmente, o sistema de nivelamento morfológico bem estabelecido é amplamente utilizado para a avaliação embrionária devido à sua fácil disponibilidade e natureza não invasiva. No entanto, demonstrou-se que a avaliação morfológica só pode fornecer informações limitadas sobre a qualidade do embrião1 e o potencial de implantação2. Uma razão fundamental é a sua incapacidade na avaliação da composição cromossômica dos embriões.
O aneuploidia cromossomático (número anormal da cópia dos cromossomas) é uma das causas principais que conduzem à apreensão embrionária do desenvolvimento, à falha da implantação ou à perda da gravidez. A ocorrência de aneuploidia tem sido bem documentada em embriões humanos, representando 60% − 70% em embriões de fase de clivagem3,4 e 50% − 60% em blastocistos5. Isso, em certa medida, contribuiu para o gargalo na melhoria da taxa de gestação do tratamento de fertilização in vitro (FIV), que tem mantido em torno de 35% − 40%6,7. Portanto, a seleção de embriões ADN para transferência é acreditado para ser benéfico para melhorar os resultados da gravidez. Para isso, o teste genético pré-implante para aneuploidia (PGT-A) tem sido desenvolvido para investigar a viabilidade embrionária utilizando abordagens genéticas. Há um número crescente de ensaios controlados randomizados e estudos de coorte que apoiam o papel crucial da PGT-A. Provou-se que a aplicação de PGT-A diminui a taxa de aborto espontâneo e aumenta a taxa de gravidez clínica e taxa de implantação8, taxa de gravidez em curso e taxa de natalidade ao vivo9.
Historicamente, os métodos diferentes foram aplicados em PGT-A, tal como A hibridação in situ da fluorescência (peixes), A hibridação genomic comparativa (CGH), o array-CGH, e o polimorfismo único do nucleotide (SNP)-microarray. Estudos prévios indicaram que a PGT-A para embriões em fase de clivagem por FISH produz resultados que são pouco consistentes com aqueles obtidos por triagem cromossômica abrangente (CCS) de blastocistos correspondentes usando 59273array-CGH ou SNP-microarray5927310. Estas discrepâncias podem ser atribuídas ao mosaicism cromossomático, aos artefatos técnicos dos peixes, ou à Self-correção embrionário de erros cromossomáticos da segregação durante o desenvolvimento11. Tem sido amplamente reconhecido que o uso de biópsias de blastocist trofectoderma (te) para PGT-A baseado em array, como array-CGH ou SNP-microarray, é eficaz para identificar o desequilíbrio cromossômico em embriões10,12. Recentemente, o sequenciamento de célula única de última geração (NGS) fornece uma abordagem de alta taxa de transferência e custo-benefício para análise genética e demonstrou aplicabilidade clínica no PGT-a13,14,15, o que o torna um alternativa promissora aos métodos atualmente disponíveis.
Aqui, apresentamos um método NGS baseado em sequenciamento de semicondutores rápido, robusto e de baixo custo para a triagem de aneuploidia em embriões humanos. A primeira etapa do fluxo de trabalho é a amplificação do genoma inteiro (WGA) do espécime biópsia do embrião, usando um jogo de WGA da único-pilha, seguido pela construção da biblioteca de sequenciação, e seqüenciamento subseqüente no sistema de sequenciamento do semicondutor.
Através da detecção dos íons H+ que são liberados de cada incorporação de trifosfato de deoxyribonucleosside durante a síntese da costa do ADN, o sistema transfere os sinais químicos (mudança do pH) capturados pelos elementos do semicondutor para dirigir dados digitais , que são interpretados mais na informação da seqüência do ADN. Eliminando a exigência para a deteção ótica cara e as reações de sequenciação complexas, esta química de sequenciação simples reduz o custo total do reagente e encurta o tempo running de sequenciamento em 2 − 4 horas16. Mais importante, com base nas especificações de desempenho do fabricante, a plataforma de sequenciamento de semicondutores pode gerar até 15 GB de dados de sequenciamento (depende da qualidade da biblioteca) por execução, que é significativamente maior do que alguns dos outros sequenciadores produzindo somente em torno de 3 − 4 dados do GB (com 2 x 75 BP leu o comprimento)17. Em aplicações clínicas de PGT-A, esta plataforma pode conseguir 24 amostras por a microplaqueta que gera até 80 milhões leituras17 e pelo menos 1 milhão leituras originais de cada amostra. A profundidade de leitura pode garantir que cada amostra tenha pelo menos 0,05 x de cobertura total do genoma. As vantagens acima desta plataforma fazem-lhe um método ideal da seleção e assim, facilitam suas aplicações largas em PGT-A18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diferente de outras químicas de sequenciamento, o sequenciador descrito aqui usa semicondutores para a detecção de nucleotídeos. A microplaqueta própria é um dispositivo eletrônico que detecte íons de hidrogênio pela incorporação base polymerase-conduzida17, que permite o tempo de sequenciamento de 2 − 4 h do programa do Proton. Além disso, a microplaqueta é uma microplaqueta do micropoço que permita a localização de uma molécula do alvo, que seja diferente da química de sequen…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado pelo fundo de investigação geral (ref n º 14162417) de Hong Kong, a Fundação Nacional de ciências naturais da China (ref n º 81860272), o principal plano de investigação da Fundação provincial de ciência e tecnologia de Guangxi (ref no. AB16380219), e a concessão da Fundação da ciência de Postdoutorado de China (ref no. 2018M630993) de China.
Materials
| PCR tubes, 0.2 mL | Axygen | PCR-02D-C | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
| PBS, pH 7.4, Ca2+ and Mg2+ free | ThermoFisher | 10010023 | |
| 1.0 M NaOH (1.0N) solution | SIGMA-ALDRICH | S2567 | For Melt-off solution. Molecular grade |
| Eppendorf LoBind Tubes, 1.5 mL | Fisher Scientific | 13-698-791 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| ELGA PURELAB Flex 3 Water Purification System or Equivalent 18 MΩ water system |
ThermoFisher | 4474524 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| PicoPLEX WGA Amplification buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| PicoPLEX WGA Amplification enzyme | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Ion OneTouch Amplification Plate | In kit: Ion OneTouch 2 Supplies (Part No. A26367). Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Ion PI Annealing Buffer | |||
| MyOne Beads Capture Solution | |||
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939AA | |
| Ion OneTouch Breaking Solution (black cap) | In kit: Ion PI Hi‑Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | ThermoFisher | 65001 | |
| PicoPLEX WGA Cell extraction buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-00. |
| PicoPLEX WGA Cell extraction enzyme | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Ion PI Chip Kit v3 | ThermoFisher | A26771 | |
| Ion Chip Minifuge, 230 V | ThermoFisher | 4479673 | |
| Ion PI dATP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI dCTP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI dGTP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| ThermoQ–Temperature Dry Bath | TAMAR | HB-T2-A | |
| NEBNext dsDNA Fragmentase | New England Biolabs | M0348L | |
| NEBNext dsDNA Fragmentase | New England Biolabs | M0348L | |
| Ion PI dTTP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion OneTouch 2 Instrument | ThermoFisher | INS1005527 | ThermoFisher Catalog number: 4474778. |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| Ion One Touch ES | ThermoFisher | 8441-22 | ThermoFisher Catalog number: 4469495. Extended kit component in Sheet 5 |
| Ethanol | SIGMA-ALDRICH | 51976 | This can be replaced by any brand's molecular grade absolute ethanol. |
| PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-01. |
| PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-02. |
| Qubit 3.0 Fluorometer | ThermoFisher | Q33216 | This model has been replaced by Qubit 4 Fluorometer, Catalog number: Q33226. |
| Qubit ds DNA HS Assay kit | ThermoFisher | M2002-02 | |
| Qubit Assay Tubes | ThermoFisher | Q32856 | |
| Ion PI Foaming Solution | ThermoFisher | A26772 | |
| Index for barcoding of libraries | BaseCare | this is a in-house prepared index. Users can buy commercial product from ThermoFisher Ion Xpress Barcode Adapters Kits (Cat. No. 4474517) | |
| Ion PI Loading Buffer | ThermoFisher | A26772 | |
| Solid(TM) Buffer Kit-1X Low TE Buffer | ThermoFisher | 4389764 | |
| Agencour AMPure XP Kit | Beckman Coulter | A63880 | |
| DynaMag-2 magnet (magnetic rack) | ThermoFisher | 12321D | |
| Ion PI Master Mix PCR buffer | |||
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Micro 17 | 75002430 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| Nuclease-free water | ThermoFisher | AM9922 | This can be replaced by other brand. |
| PicoPLEX WGA Nuclease-free water | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Ion OneTouch Oil bottle | Ion PI Hi‑Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | Extended kit component in Sheet 3 |
| double-strand DNA standard | This is a in-house prepared DNA standard for calibration of Qubit before quantification of library. | ||
| PicoPLEX WGA Preamplification buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| PicoPLEX WGA Preamplification enzyme | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Library Amplification Primer Mix | ThermoFisher | 4471252 | Extended kit component in Sheet 3 |
| Ion OneTouch Reaction Filter | Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Recovery Router | Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Recovery Tubes | Extended kit component in Sheet 5 | ||
| ISP Resuspension Solution | |||
| Ion Proton | ThermoFisher | DA8600 | This model is imported by Da An Gene Co.,LTD. of Sun Yat-Sen University from ThermoFisher and has been certified by China Food and Drug Administration for clinical application. The catalog number in ThermoFisher is 4476610. |
| Ion PI Hi‑Q Sequencing Polymerase | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI Sequencing Primer | |||
| server for sequencer | Lenovo | T260 | |
| Ion PI Sphere Particles | |||
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | ThermoFisher | 4471252 | |
| Nalgene 25mm Syringe Filters | ThermoFisher | 724-2045 | Pore size: 0.45μm. Specifically for aqueous fluids. |
| Ion PI Hi‑Q W2 Solution | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI 1X W3 Solution | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion OneTouch Wash Solution C1 | |||
| The Ion PGM Hi‑Q View Sequencing Kit | ThermoFisher | A30044 | Extended kit component in Sheet 2 |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | Extended kit component in Sheet 3 |
| Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit (1 sequencing run per initialization) | ThermoFisher | A26772 | Extended kit component in Sheet 4 |
| Ion PI Hi‑Q OT2 200 Kit | ThermoFisher | A26434 | Extended kit component in Sheet 5 |
Referências
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