Kolorimetrisk analyse af basisk fosfataseaktivitet i S. aureus Biofilm

Summary

I dette manuskript etablerede vi en høj overførselshastighed metode til at kvantificere alkalisk fosfataseaktivitet i S. aureus biofilm kultur fra 96-brønd vævskultur plade

Abstract

Alkalisk fosfatase (ALP) er en fælles enzym udtrykt i både prokaryote og eukaryote celler. Det katalyserer hydrolyse af fosfat monoesters fra mange molekyler på grundlæggende pH og spiller en uundværlig rolle i fosfat stofskiftet. Hos mennesker er eukaryote ALP en af de hyppigst anvendte enzymatisk signaler i diagnosticering af forskellige sygdomme, såsom kolestase og rakitis. I S. aureus, ALP registreres udelukkende på cellemembranen; Det er også udtrykt som en sekretoriske form så godt. Men lidt er kendt om dens funktion i Biofilmdannelse.

Formålet med dette manuskript er at udvikle en hurtig og pålidelig analyse for at måle ALP aktivitet i S. aureus biofilm, der ikke kræver protein isolation. Brug af p-nitrophenylfosfat fosfat (pNPP) som substrat, målte vi ALP aktivitet i S. aureus biofilm dannet i 96-brønd vævskultur plader. Aktivitet var baseret på dannelsen af de opløselige reaktionsprodukt målt ved 405 nm absorbans. Den høje overførselshastighed karakter af 96 godt vævskultur plade metode giver en følsom og reproducerbar metode til ALP aktivitet assays. Den samme eksperimentelle oprettet kan også udvides til at måle andre ekstracellulære molekylære markører relateret til Biofilmdannelse.

Introduction

Alkalisk fosfatase (ALP) er allestedsnærværende udtrykt i både prokaryote og eukaryote celler¹. Det kan katalyserer hydrolyse af monophosphate fra forskellige molekyler som nukleotider, proteiner, alkaloider, fosfat estere og anhydrider af fosforsyre. Hos mennesker findes eukaryote ALP i mange væv, herunder lever, knogle, tarmen og moderkagen². Det spiller vigtige roller i protein fosforylering, cellevækst, apoptose, stamcelle processer samt normale skelet mineralisering. Eukaryote ALP er også en vigtig serum indikator for tilstedeværelsen af sygdomme i knogler, leveren og andre væv/organer når forhøjet^3,4.

Prokaryote ALP er blevet opdaget i en bred vifte af bakterieceller, herunder E. coli⁵, S. aureus^6,7 og nogle fælles vommen bakterier i jord⁸. Bakteriel ALP aktivitet har været brugt som en biosensor i påvisning af pesticider, tungmetaller⁹ og bakteriel forurening¹⁰. Den konstitutive udtryk for ALP har været anvendt til identifikation af stafylokokker¹¹ og at differentiere Serratia fra Enterobacter¹². Yderligere foreslås det, at konstitutiv ALP produktion er korreleret med sygdomsfremkaldende stafylokokker¹³. Selvom ALP er blevet undersøgt i forskellige indstillinger^3,4, men lidt er rapporteret for sin aktivitet og funktion i biofilm kulturer.

En biofilm er dokumenteret for at have en anderledes fungerende bakteriel liv sammenlignet med dens fritlevende bakteriel celle modstykke¹⁴. I S. aureus, blevet dannelse af biofilm identificeret i en række kliniske tilstande og konti for antibiotikaresistens og kronisk inflammation^15,16. Mange molekyler var blevet rapporteret at være fundet i en biofilm matrix som polysaccharider, proteiner, nukleinsyrer og lipider, men mekanismen i Biofilmdannelse er ikke fuldt forstået¹⁴. For at forstå rollen af ALP i Biofilmdannelse, vi kulturperler S. aureus biofilm i 96 godt vævskultur plader og målt ALP aktivitet ved hjælp af para-nitrophenylphosphate (pNPP).

Molekyle pNPP er en klar-til-brug substrat for ALP og har været meget anvendt til at måle ALP aktivitet^6,17,18. Denne kolorimetriske assay er baseret på konvertering af para-nitrophenylfosfat fosfat (pNPP) til para-nitrofenol resulterer i et farvet produkt ved 405 nm. I forhold til andre konventionelle ALP assay, såsom Agarosen gel elektroforese¹⁹, hvedekim agglutinin (WGA) nedbør, og WGA-HPLC²⁰, denne analyse er meget specifikke, følsomme, let at reproducere, og de fleste vigtigere, giver mulighed for høj overførselshastighed.

Protocol

1. medium forberedelse Forberede 1 L af Tryptic soja bouillon (TSB): I 1 L destilleret vand, tilsættes 15 g af pancreas fordøje af kasein, 5 g af papaic udtog af sojaskrå, 3 g natriumchlorid, 2,5 g af dextrose og 2,5 g af dikalium fosfat. Sterilisere før brug. For Tryptic soja Agar (TSA), tilsættes 15 g agar til 1 L af TSB, autoklave. Så lad det køle ned til stuetemperatur. Næste, hæld i forholdet 20 mL per petriskål (100 mm x 15 mm). Biofilm næringssubstratet: tilsættes 10 g glu…

Representative Results

Figur 1 viser et repræsentativt resultat af ALP aktivitet fra biofilm kulturer af S. aureus i 96 godt vævskultur plader. 75 μl af kommercielt tilgængelige pNPP løsning blev føjet til hver godt og inkuberes ved stuetemperatur. Efter inkubation i forskellige tidspunkter (0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min og 75 min, henholdsvis) 75 μl af 5 M NaOH blev føjet til reaktionen standses. Produktet blev derefter målt i en 96 godt Pladelæser ved 4…

Discussion

I vores analyse brugte vi pNPP som ALP substrat. Dette er en arbejdsgruppe løsning designet til ELISA og ingen fortynding er nødvendig. Efter hydrolyse af ALP, en gul produkt udvikler og kan måles ved 405 nm. For enden af enzymatisk reaktion vi kortvarigt centrifugeres 96 godt pladen og overførte supernatanten til en frisk 96 godt plade til måling af absorbans ved hjælp af i pladelæseren. Vi fandt, at denne ekstra centrifugering skridt er kritisk, da det forøger konsistens af absorbans ved 405 nm, formentlig ved …

Materials

Agar	VWR	9002-18-0
Eppendorf Centrifuge	Thomas Scientific	5810
Gluose	VWR	50-99-7
NaOH pellets	VWR	SS0550-500GR
Para-nitrophenylphosphate (pNPP)	Sigma	P7998-100ML	Typical concentrations of pNPP liquid substrates, often used in enzyme-linked immunesorbent assays (ELISA), range between 10 to 50 mM. Similar to most ready-to-use pNPP liquid substrates like the one used here, the exact pNPP concentration is not disclosed due to its proprietary nature.
10X PBS, pH7.4. 173 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4	Sigma	P3288-1VL
Plate Reader	Biotek	ELx808
S. aureus	ATCC	ATCC25923
Tryptic Soy Agar       15g / L TSB	VWR	9002-18-0
Tryptic Soy Broth:      g/L Pancreatic Digest of Casein………… 15.0 Papaic Digest of Soyben Meal………5.00 Sodium chloride………………………… 3.00 Dextrose………………………………….  2.50 Dipotassium phosphate………………2.50	VWR	90006-098
96 well tissue culture plates	BD	6902D09	U shaped bottom