Rask Lipid slippverktøy isolasjon protokollen bruker en Well-established Organelle isolering Kit
Summary
Denne protokollen etablerer en ny metode for lipid slippverktøy isolasjon og rensing fra musen lever, bruker en veletablert endoplasmatiske retikulum isolering kit.
Abstract
Lipid dråper (LDs) er bioaktive organelles funnet i stoffer i de fleste eukaryotic og noen prokaryote celler. LDs består av nøytrale lipider omsluttet av en monolayer av fosfolipider og proteiner. Hepatic LD lipider, som ceramides og proteiner er innblandet i flere sykdommer som forårsaker nedsatt Steatose. Selv om tidligere metoder har blitt opprettet for LD isolasjon, de krever en tidkrevende forberedelse av reagenser og er ikke utformet for isolering av flere subcellular rom. Vi forsøkte å etablere en ny protokoll for å aktivere isolering av LDs, endoplasmatiske retikulum (ER) og lysosomer fra en enkelt musen lever.
Videre, reagenser i protokollen presenteres her er kommersielt tilgjengelig og krever minimal reagens forberedelse uten å ofre LD renhet. Her presenterer vi data sammenligne denne nye protokollen til en standard sukrose gradient protokoll, demonstrere sammenlignbare renhet, morfologi og avkastning. I tillegg kan vi isolere ER og lysosomer bruker samme prøven, gir innsikt i dannelsen og intracellulær fluks av lipider og deres tilhørende proteiner.
Introduction
LDs er bioaktive organelles funnet i stoffer i de fleste eukaryotic celler og noen prokaryote celler1,2,3. LD kjernen består av nøytrale lipider som triglyserider (TG) og kolesterol estere. De inneholder også ceramides, bioaktive lipider involvert i cellulær signalnettverk trasé4,5. LDs er omgitt av en phospholipid monolayer og belagt med proteiner, inkludert perilipin proteiner perilipin 2 (PLIN2) og 3 (PLIN3)1,5,6. Også tilstede er lipogenic enzymer og lipases membran menneskehandel proteiner som er koblet til flere hepatisk steatotic sykdommer, inkludert alkoholfrie fatty leversykdom, alkoholholdige leversykdom og hepatitt C3,5 ,,6,,7,,8,,9,,10.
LDs er tenkt å danne fra den ytre membranen av ER og inneholder nylig syntetisert TG fra ER-avledet frie fettsyrer11. Men det er ukjent om de grupperte lipider bud, forbli tilkoblet eller er forbrukeravgift fra ER6,11, gjør isolasjon av LDs fri fra ER teknisk utfordrende. Frie fettsyrer kan være frigjort fra LDs av overflate lipases å gi for energiproduksjon eller membran syntese. I tillegg kan LDs være dårligere via lipophagy som en regulerende mekanisme og produsere frie fettsyrer12.
I tillegg ER og lysosomer, finnes det andre-som mitokondrier, endosomes, peroxisomes og plasma membranen, som finnes i nært samarbeid med LDs11. Denne stramt polygami gjør det vanskelig å utføre en ren LD utvinning. Men kan nøytral lipider medfødte lav tetthet bli tatt nytte av via sentrifugering5.
LDs har tradisjonelt vært isolert bruker en sukrose tetthet gradert1,5,13. Disse metodene har imidlertid ikke utviklet å isolere andre. I tillegg krever de tidkrevende forberedelse av reagenser. Denne protokollen tilpasser en kommersielt tilgjengelig ER isolering kit (se Tabell for materiale) for å tillate LD isolasjon. Vi bruker utvinning bufferen fra settet, legge en LD isolasjon trinn. Videre kan protokollen også brukes for ER og lysosomale isolasjon de samme utvalg, muliggjør en mer omfattende bilde av livet syklus av LDs. For å validere denne nye metoden, analysen vi LD avkastning, morfologi, størrelse og renhet. Vi sammenligne resultatene presenteres her for de med en brukte protokollen utnytter sucrose gradering LD isolering.
Vi brukte en 10 – 12 uke-gamle, 20 g kvinnelige C57BL/6 musen fastet 16 h (mat fjerning på 5 kl. 9: am LD isolasjon tid) med gratis tilgang til vann. Den typiske avkastningen for TG er 0.6 mg/g leveren, og LD protein, er det 0,25 mg/g leveren. Dette gir nok materiale til ~ 10 immunoblots SDS side. Protokollen nedenfor detaljer reagensene brukes og en protokoll som er egnet for en enkelt 1 g lever. Sukrose gradient isolasjon protokollen er tilpasset fra Sato14 og Wu15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hepatic LD biologi er stadig blir anerkjent som en viktig regulator av hepatocellulært fysiologi i både helse og sykdom. Som bona fide organeller, LDs er dynamiske, samhandle med andre cellulære strukturer og inneholde innenfor dem bioaktive komponenter involvert i både lipid og glukose homeostase. Sukrose forløpningen brukes rutinemessig LD isolering og aktiverer etterforskerne å studere LD struktur, men det krever dem til å gjøre flere buffere. Vi har vist at bruk av en kommersielt tilgjengelig ER isolering kit…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Abramson familie Cancer Research Institute. Dette arbeidet er støttet av følgende bevilgninger: NIH/NIAAA R01 AA026302-01, NIH/NIAAA K08-AA021424, Robert Wood Johnson Foundation, Harold Amos medisinske fakultet Development Award, 7158, IDOM DRC Pilot Award P30 DK019525 (R.M.C.); NIH/NIAAA F32-AA024347 (JC). Dette arbeidet var støttes delvis av NIH P30-DK050306 og fasilitetene kjernen (molekylær patologi og Imaging Core molekylærbiologi/Gene Expression kjernen og celle kultur kjernen) og sin pilot gi programmet. Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet til National Institutes of Health.
Materials
| BioExpress Vortex Mixer | GeneMate | S-3200-1 | Vortex Mixer |
| Centrifuge 54242 R | Eppendorf | 54242 R | Refrigerated Counter Microcentrifuge Rotor: FA-45-24-11 |
| Centrifuge Sorvall RC6 + | Thermo Scientific | RC6+ | Refrigerated High Speed Centrifuge Rotor: F21S-8x50y |
| Centrifuge Sorvall Legend RT+ | Thermo Scientific | Legend RT+ | Refrigerated High Capacity Centrifuge Rotor: 75006445 Bucket: 75006441 |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | 04 693 116 001 | Protease Inhibitor Tablets |
| Diagenode Bioruptur UCD-200 | Diagenode | UCD-200 | Sonication System |
| Dounce Tissue Grinder (45 mL) | Wheaton | 357546 | Use Loose pestle |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) | Corning | 21-031-CM | |
| Endoplasmic Reticulum Isolation Kit | Sigma Aldrich | ER0100 | For ER kit Extraction: Contains: Isotonic Extraction Buffer 5X 100 mL Hypotonic Extraction Buffer 10 mL Calcium chloride, 2.5 M solution 5 mL OptiPrep Density Gradient Medium 100 mL Blunt Nosed Needle 1 ea. |
| External light source for flourescent excitation | Leica | Leica EL6000 | |
| Hydrochloric acid | Sigma Aldrich | H1758 | Hydrochloric Acid |
| ImageJ | Image Analysis Software | ||
| Inverted Modulating Contrast Microscope | Leica | Leica DM IRB | |
| Lysosome Enrichment Kit for Tissues and Cultured Cells | Thermo Fisher Scientific | 89839 | For Lysosome Isolation |
| Microscope Camera | Qimaging | QICAM fast 1394 | |
| Optima XL-100K Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | XL-100K | Ultracentrifuge Rotor: SW41Ti |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 22-042817 | |
| Petri Dish 5 cm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| PhosSTOP | Sigma Aldrich | 04 906 845 001 | Phosphatase Inhibior Tablets |
| Sterile Surgical Blade #10 | Pioneer | S2646 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | Crystalline/Certified ACS |
| Triglyceride Liquicolor Kit | Stanbio | 2200-225 | Colorimetric Triglyceride kit |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | For TE buffer |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151-100 | 5%, Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether, Protein Lysis Reagent |
| UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0) | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | For TE buffer |
Referências
- Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of Lipid Droplets from Cells by Density Gradient Centrifugation. Current Protocols in Cell Biology. 72, (2016).
- Ding, Y., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nature Protocols. 8 (1), 43-51 (2013).
- Gao, Q., Goodman, J. M. The lipid droplet-a well-connected organelle. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 49 (2015).
- Correnti, J. M., et al. Ethanol and C2 ceramide activate fatty acid oxidation in human hepatoma cells. Scientific Reports. 8 (1), 12923 (2018).
- Williams, B., et al. A novel role for ceramide synthase 6 in mouse and human alcoholic steatosis. FASEB Journal. 32 (1), 130-142 (2018).
- Carr, R. M., Ahima, R. S. Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases. Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).
- Carr, R. M., et al. Perilipin Staining Distinguishes Between Steatosis and Nonalcoholic. Steatohepatitis in Adults and Children. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 15 (1), 145-147 (2017).
- Carr, R. M., et al. Reduction of TIP47 improves hepatic steatosis and glucose homeostasis in mice. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (8), R996-R1003 (2012).
- Carr, R. M., Peralta, G., Yin, X., Ahima, R. S. Absence of perilipin 2 prevents hepatic steatosis, glucose intolerance and ceramide accumulation in alcohol-fed mice. PLoS One. 9 (5), e97118 (2014).
- Tsai, T. H., et al. The constitutive lipid droplet protein PLIN2 regulates autophagy in liver. Autophagy. 13 (7), 1130-1144 (2017).
- Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. Journal of Cell Science. 122 (Pt 6), 749-752 (2009).
- Liu, K., Czaja, M. J. Regulation of lipid stores and metabolism by lipophagy. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 3-11 (2013).
- Mannik, J., Meyers, A., Dalhaimer, P. Isolation of cellular lipid droplets: two purification techniques starting from yeast cells and human placentas. Journal of Visualized Experiments. (86), e509814 (2014).
- Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. Journal of Biochemistry. 139 (5), 921-930 (2006).
- Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R., McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21 (16), 3470-3482 (2000).
- Zhang, S., et al. Morphologically and Functionally Distinct Lipid Droplet Subpopulations. Scientific Reports. 6, 29539 (2016).
