Rening av dendritiska Filopodia-rik fraktion
Summary
I detta protokoll introducerar vi en metod för rening av dendritiska filopodia-rika fraktionen från fagocytiska Cup-liknande utskjutande struktur på odlade Hippocampus nervceller genom att dra nytta av den specifika och starka samhörighet mellan en dendritiska filopodial adhesion molekyl, TLCN, och en extracellulär matris molekyl, vitronectin.
Abstract
Dendritic filopodia är tunna och långa utskjutande bygger på aktin glödtråden, och de sträcker sig och dra som om du söker efter ett mål Axon. När dendritiska filopodia etablera kontakt med ett mål Axon, börjar de mognar i taggar, vilket leder till bildandet av en Synapse. Telencephalin (tlcn) är rikligt lokaliserad i dendritiska filopodia och gradvis utesluts från taggar. Överuttryck av TLCN i odlade Hippocampus nervceller inducerar dendritiska filopodia formation. Vi visade att telencephalin starkt binder till en extracellulär matrix molekyl, vitronectin. Vitronectin-belagda mikropärlor inducerad fagocytos kopp bildas på neuronala dendriter. I fagocytos Cup, tlcn, tlcn-bindande proteiner såsom fosforylerade Ezrin/radixin/moesin (Phospho-ERM), och F-Actin ackumuleras, vilket tyder på att komponenterna i fagocytos Cup liknar dendritiska filopodia. Således utvecklade vi en metod för rening av fagocytos Cup istället för dendritiska filopodia. Magnetisk polystyren pärlor var belagda med vitronectin, som är rikligt närvarande i kulturen medium Hippocampus nervceller och som inducerar fagocytos Cup formation på neuronala dendriter. Efter 24 h av inkubering, de fagocytos kopparna var milt solubilized med rengöringsmedel och samlas med hjälp av en magnet separator. Efter tvättning av pärlor, var bindande proteiner elueras och analyseras med silver färgning och Western blotting. I bindnings delen var tlcn och aktin rikligt närvarande. Dessutom var många proteiner som identifierats från fraktionen lokaliserade till dendritiska filopodia; Sålunda, vi kallade den bindande fraktionen som dendritiska filopodia-rika fraktion. Den här artikeln beskriver detaljer om reningsmetoden för den dendritiska filopodia-rika fraktionen.
Introduction
Dendritic filopodia tros vara föregångare till SPINES. Actin glödtrådar i dendritiska filopodia reglera deras förlängning och indragning1,2,3. Efter kontakt med en Axon, valda dendritiska filopodia börjar sin mognad i taggar, och en synaps bildas4,5. Komponenterna i taggar har fastställts från omfattande analys av postsynaptiska densitet fraktioner6,7, medan komponenterna i dendritiska filopodia fortfarande i stort sett okända. Det har visats att telencephalin (tlcn), ERM, syngap, ras, PI3 kinas, akt, mTOR, Polo-liknande Kinas 2, camkii, syndecan-2, paralemin-1, ARF6, och EphB reglera dendritiska filopodia formation5,8,9 ,10,11, medan en metod inte har utvecklats för en omfattande analys av molekyler som finns i dendritiska filopodia.
Tlcn (ICAM-5) är uttryckligen uttrycks av taggig nervceller i de mest rostralt hjärn segmentet, den telencephalon12. TLCN har 9 ig-liknande domäner i sin extracellulära regionen, en transmembranregion, och en cytoplasmisk svans13. Tlcn binder till aktie (VN) och LFA-1 integrin i dess extracellulära regionen, till presenilin i dess transmembranregionen, och till Phospho-ERM och α-actinin i dess cytoplasmiska region5,8,14,15 ,16. Tlcn binder till aktin cytoskelettet genom Phospho-ERM på spetsarna av dendritiska filopodia och α-actinin i taggar och dendritiska axlar8,16.
Vi visade att överuttryck av tlcn förstärkt dendritiska filopodia formation och inducerade återgång av taggar till filopodia10. Den konstitutiva aktiva formen av Ezrin bunden till TLCN cytoplasmiska regionen och förstärkt dendritiska filopodia formation8. Sålunda reglerar TLCN dendritiska filopodia formation genom Actin-bindande proteiner. Esselens et al. visade att mikrokulor inducerad tlcn ackumulering på odlade nervceller17. Vi visade att fagocytiska Cup strukturer bildades på neuronala dendriter runt VN-belagda mikrokulor i en tlcn-beroende sätt15. Beståndsdelar i dendritiska filopodia liknar de i fagocytos Cup. Det är svårt att samla dendritiska filopodia, men det är relativt lättare att samla fagocytos kopp med magnetiska mikropärlor. Således utvecklade vi en metod för att rena fagocytos Cup istället för dendritiska filopodia18. Här beskriver vi reningsmetoden för den dendritiska filopodia-rika fraktionen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi utvecklade en reningsmetod för den dendritiska filopodia-rika fraktionen med hjälp av affinitet mellan celladhesionmolekylen TLCN och det extracellulära matrix proteinet vitronectin. Jämfört med PSD fraktion, det kan vara möjligt att identifiera de synaptiska proteiner som verkar på omogen synapsen från dendritiska filopodia-rika fraktionen. Sålunda, beståndsdelarna i dendritiska filopodia-rika fraktionen skiljer sig från de av PSD fraktion av 74%. Skiljer sig från PSD fraktion, vi använde odlade Hippocam…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Shigeo Okabe och Hitomi Matsuno för låg densitet kulturen i hippocampus nervceller, Masayoshi Mishina för TLCN-brist möss, Sachiko Mitsui och Momoko Shiozaki för tekniskt stöd, och medlemmar av Yoshihara laboratorium för hjälpsamma diskussioner . Detta arbete stöddes av JSPS KAKENHI Grant nos. JP20700307, JP22700354, och JP24500392 och MEXT KAKENHI Grant nos. JP23123525 till YF och JP20022046, JP18H04683 och JP18H05146 till YY.
Materials
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 1.7 ml Low Binding MCT | Sorenson BioScience | 39640T | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 2530149 | |
| 35-mm plastic cell culture dishes | Corning | 430165 | |
| Anti-actin | Sigma-Aldrich | A-5060 | |
| Anti-alpha-Actinin | Sigma-Aldrich | A-5044 | |
| Anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T-9026 | |
| Anti-Ezrin | Sigma-Aldrich | clone3C12, SAB4200806 | |
| Anti-Galphaq | Santacruz | sc-393 | |
| Anti-MAP2 | Chemicon | clone AP20, MAB3418 | |
| Anti-Moesin | Sigma-Aldrich | clone 38/87, M7060 | |
| Anti-PLCbeta1 | Santacuz | sc-5291 | |
| Anti-PSD95 | MA2 | ABR | |
| Anti-Spectrin beta | Chemicon | MAB1622 | |
| B27 | Gibco | 0080085SA | |
| BCA protein assay kit | Thermo | 23227 | |
| Bromophenol blue | Merck | 1.08122.0005 | |
| calcium chrolide, hydrous | Wako | 038-19735 | |
| Cell scraper | Falcon | 353085 | |
| Cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Choline chloride | Sigma-Aldrich | C7527 | |
| Complete EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Cytosine beta-D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C-6645 | |
| DNase-I | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich | P5155 | |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo | 12321D | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE | RPN2232 | |
| e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel | ATTO | E-T520L | |
| Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
| HBSS | Gibco | 14175095 | |
| HRP-conjugated anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| i-Inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | |
| LAS-1000 mini | Fuji Film | LAS-1000 mini | For detection of luminescence from WB membrane |
| Magnetic polystyrene microbeads | Sperotech | PM-20-10 | |
| MEM amino acid solution | Gibco | 11130-051 | 30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine |
| Mini-slab size electrophoresis system | ATTO | AE-6530 | |
| Niacinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Penicilin / Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail | Roche | 4906845001 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Nacali | 28360-14 | |
| Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P6155 | |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | R9504 | |
| Silver Stain 2 Kit wako | Wako | 291-5031 | |
| Thiamine HCl | Sigma-Aldrich | T1270 | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 1703940JA | |
| Ultra pure water | MilliQ | For production of ultra pure water |
Referências
- Fiala, J. C., Feinberg, M., Popov, V., Harris, K. M. Synaptogenesis via dendritic filopodia in developing hippocampal area CA1. Journal of Neuroscience. 18 (21), 8900-8911 (1998).
- Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia. Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).
- Ziv, N. E., Smith, S. J. Evidence for a role of dendritic filopodia in synaptogenesis and spine formation. Neuron. 17 (1), 91-102 (1996).
- Lohmann, C., Bonhoeffer, T. A role for local calcium signaling in rapid synaptic partner selection by dendritic filopodia. Neuron. 59 (2), 253-260 (2008).
- Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. Dendritic spine formation and stabilization. Current Opinion in Neurobiology. 19 (2), 146-153 (2009).
- Bayes, A., et al. Comparative study of human and mouse postsynaptic proteomes finds high compositional conservation and abundance differences for key synaptic proteins. PLoS One. 7 (10), e46683 (2012).
- Bayes, A., et al. Characterization of the proteome, diseases and evolution of the human postsynaptic density. Nature Neuroscience. 14 (1), 19-21 (2011).
- Furutani, Y., et al. Interaction between telencephalin and ERM family proteins mediates dendritic filopodia formation. Journal of Neuroscience. 27 (33), 8866-8876 (2007).
- Mao, Y. T., et al. Filopodia Conduct Target Selection in Cortical Neurons Using Differences in Signal Kinetics of a Single Kinase. Neuron. 98 (4), 767-782 (2018).
- Matsuno, H., et al. Telencephalin slows spine maturation. Journal of Neuroscience. 26 (6), 1776-1786 (2006).
- Raemaekers, T., et al. ARF6-mediated endosomal transport of Telencephalin affects dendritic filopodia-to-spine maturation. The EMBO Journal. 31 (15), 3252-3269 (2012).
- Mori, K., Fujita, S. C., Watanabe, Y., Obata, K., Hayaishi, O. Telencephalon-specific antigen identified by monoclonal antibody. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (11), 3921-3925 (1987).
- Yoshihara, Y., Mori, K. Telencephalin: a neuronal area code molecule?. Neuroscience Research. 21 (2), 119-124 (1994).
- Annaert, W. G., et al. Interaction with telencephalin and the amyloid precursor protein predicts a ring structure for presenilins. Neuron. 32 (4), 579-589 (2001).
- Furutani, Y., et al. Vitronectin induces phosphorylation of ezrin/radixin/moesin actin-binding proteins through binding to its novel neuronal receptor telencephalin. Journal of Biological Chemistry. 287 (46), 39041-39049 (2012).
- Nyman-Huttunen, H., Tian, L., Ning, L., Gahmberg, C. G. alpha-Actinin-dependent cytoskeletal anchorage is important for ICAM-5-mediated neuritic outgrowth. Journal of Cell Biology. 119 (Pt 15), 3057-3066 (2006).
- Esselens, C., et al. Presenilin 1 mediates the turnover of telencephalin in hippocampal neurons via an autophagic degradative pathway. Journal of Cell Biology. 166 (7), 1041-1054 (2004).
- Furutani, Y., Yoshihara, Y. Proteomic Analysis of Dendritic Filopodia-Rich Fraction Isolated by Telencephalin and Vitronectin Interaction. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 27 (2018).
- Lu, Z., Piechowicz, M., Qiu, S. A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).
- Okabe, S., Miwa, A., Okado, H. Alternative splicing of the C-terminal domain regulates cell surface expression of the NMDA receptor NR1 subunit. The Journal of Neuroscience. 19 (18), 7781-7792 (1999).
- Okabe, S., Vicario-Abejon, C., Segal, M., McKay, R. D. Survival and synaptogenesis of hippocampal neurons without NMDA receptor function in culture. European Journal of Neuroscience. 10 (6), 2192-2198 (1998).
