Generatie van 3D huid Organoid van koord bloed afkomstige geïnduceerde pluripotente stamcellen
Summary
Wij stellen voor een protocol dat laat zien hoe geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige keratinocyten en fibroblasten differentiëren en genereren een 3D huid organoid, met behulp van deze keratinocyten en fibroblasten. Dit protocol bevat een extra stap van het genereren van een gehumaniseerd muizen model. De techniek die hier gepresenteerd zal dermatologische onderzoek verbeteren.
Abstract
De huid is het grootste orgaan van het lichaam en heeft vele functies. De huid fungeert als een fysieke barrière en de beschermer van het lichaam en regelt lichaamsfuncties. Biomimetics is de nabootsing van de modellen, systemen en elementen van de natuur met het oog op het oplossen van complexe menselijke problemen1. Huid biomimetics is een nuttig instrument voor onderzoek van de ziekte in vitro en in vivo regeneratieve geneeskunde. Menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) hebben het kenmerk van onbeperkte proliferatie en de mogelijkheid van differentiatie op drie lagen van de kiem. Menselijke iPSCs worden gegenereerd uit verschillende primaire cellen, zoals cellen van het bloed, keratinocyten, fibroblasten en meer. Onder hen, hebben koord bloed mononucleaire cellen (CBMCs) naar voren gekomen als een bron van alternatieve cel vanuit het perspectief van allogene regeneratieve geneeskunde. CBMCs zijn nuttig in de regeneratieve geneeskunde omdat menselijke leukocyten antigeen (HLA) te typen naar de cel bankwezen essentieel. Wij bieden een methode voor de differentiatie van CBMC-iPSCs in keratinocyten en fibroblasten en generatie van een 3D huid organoid. Keratinocyten CBMC-iPSC-afgeleide en fibroblasten hebben kenmerken vergelijkbaar met een oplaadbare batterij-lijn. De 3D huid organoids worden gegenereerd door een epidermale laag op een dermale laag bedekken. Door het transplanteren van deze 3D huid organoid, wordt een gehumaniseerd muizen model gegenereerd. Deze studie toont aan dat een 3D menselijke iPSC afkomstige huid organoid een nieuwe, alternatieve tool voor dermatologische onderzoek in vitro en in vivo wellicht.
Introduction
Huid heeft betrekking op de buitenste oppervlakte van het lichaam en beschermt de inwendige organen. De huid heeft verschillende functies, met inbegrip van bescherming tegen ziekteverwekkers, opvangen en opslaan van water, regulering van de lichaamstemperatuur, en lichaam afscheiden afval2. Huid protheses kunnen worden ingedeeld, afhankelijk van de bron van de huid; transplantaties met behulp van de huid van een andere donor allografts worden genoemd, en enten met de huid van de patiënt zijn autografts. Hoewel het een autograft is de aangewezen behandeling vanwege zijn lage afwijzing risico, zijn huid biopsieën moeilijk uit te voeren op patiënten met ernstige letsels of een onvoldoende aantal huidcellen. Bij patiënten met ernstige brandwonden zijn drie keer het aantal huidcellen nodig om grote gebieden bestrijken. De beperkte beschikbaarheid van huidcellen van het lichaam van een patiënt leidt tot situaties waarin allogenous transplantatie noodzakelijk is. Een allograft wordt tijdelijk gebruikt totdat autologe transplantatie kan worden uitgevoerd omdat het meestal wordt afgewezen door het immuunsysteem van de gastheer na ongeveer 1 week3. Om te overwinnen afwijzing door het immuunsysteem van de patiënt, moeten protheses komen uit een bron met dezelfde immuun identiteit als de patiënt4.
Menselijke iPSCs zijn een opkomende bron van cellen voor stamcel therapie5. Menselijke iPSCs worden gegenereerd uit lichaamscellen, met behulp van herprogrammering factoren zoals OCT4, SOX2, Klf4 en c-Myc6. Met behulp van menselijke iPSCs overwint de ethische en immunologische kwesties van embryonale stamcellen (SER’s)7,8. Menselijke iPSCs pluripotent hebben en kunt onderscheiden in drie lagen van de kiem9. De aanwezigheid van HLA, een kritische factor in de regeneratieve geneeskunde, bepaalt de immuunrespons en de mogelijkheid van verwerping10. Het gebruik van patiënt-afgeleide iPSCs verhelpt de problemen van cel-source beperking en immuunsysteem afwijzing. CBMCs hebben ook naar voren gekomen als een bron van alternatieve cel voor regeneratieve geneeskunde11. Verplichte HLA typen, die tijdens CBMC bankieren optreedt, kan gemakkelijk worden gebruikt voor onderzoek en transplantatie. Verdere, homozygoot HLA-type iPSCs kunt grote schaal toepassen van verschillende patiënten12. Een bank CBMC-iPSC is een roman en efficiënte strategie voor celtherapie en allogene regeneratieve geneeskunde12,13,14. In deze studie, wij gebruiken CBMC-iPSCs, onderscheiden in keratinocyten en fibroblasten, en genereren van gestratificeerde 3D huidlagen. Resultaten van deze studie suggereren dat een 3D huid CBMC-iPSC-afgeleide organoid een nieuwe tool voor in vitro en in vivo dermatologische onderzoek is.
Protocol
Representative Results
Discussion
Menselijke iPSCs hebben gesuggereerd als een nieuw alternatief voor gepersonaliseerde regeneratieve geneeskunde17. Gepersonaliseerde iPSCs patiënt afkomstige weerspiegelen patiënt kenmerken die kunnen worden gebruikt voor de modellering van de ziekte, drug screening, en autologe transplantatie18,19. Het gebruik van patiënt-afgeleide iPSCs kan ook problemen met betrekking tot de primaire cellen, een gebrek aan voldoende cel nummers en im…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door een subsidie van het Korea gezondheidszorg Technology R & D Project, ministerie van volksgezondheid, welzijn en familie zaken, Republiek Korea (H16C2177, H18C1178).
Materials
| Adenine | Sigma | A2786 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| AggreWell Medium (EB formation medium) | STEMCELL | 05893 | EB formation |
| Anti-Fibronectin antibody | abcam | ab23750 | Fibroblast marker |
| Anti-KRT14 antibody | abcam | ab7800 | Keratinocyte marker |
| Anti-Loricrin antibody | abcam | ab85679 | Stratum corneum marker |
| Anti-p63 antibody | abcam | ab124762 | Keratinocyte marker |
| Anti-Vimentin antibody | Santa cruz | sc-7558 | Fibroblast marker |
| BAND AID FLEXIBLE FABRIC | Johnson & Johnson | – | Bandage |
| Basement membrane matrix (Matrigel) | BD | 354277 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| BLACK SILK suture | AILEEE | SK617 | Skin graft |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | Component of epithelial medium for 3D skin organoid |
| Collagen type I | BD | 354236 | 3D skin organoid |
| Collagen type IV | Santa-cruz | sc-29010 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Defined keratinocyte-Serum Free Medium | Gibco | 10744-019 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11995065 | Component of differentiation medium |
| DMEM/F12 Medium | Gibco | 11330-032 | Component of differentiation medium |
| Essential 8 medium | Gibco | A1517001 | iPSC medium |
| FBS, Qualified | Corning | 35-015-CV | Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte |
| Glutamax Supplement | Gibco | 35050061 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| Insulin | Invtrogen | 12585-014 | Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte |
| Iris standard curved scissor | Professional | PC-02.10 | Surgical instrument |
| Keratinocyte Serum Free Medium | Gibco | 17005-042 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| L-ascorbic acid 2-phosphata sesquimagnesium salt hydrate | Sigma | A8960 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| MEM Non-Essential Amino Acid | Gibco | 1140050 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| Meriam Forceps Thumb 16 cm | HIROSE | HC 2265-1 | Surgical instrument |
| NOD.CB17-Prkdc SCID/J | The Jackson Laboratory | 001303 | Mice strain for skin graft |
| Petri dish 90 mm | Hyundai Micro | H10090 | Plastic ware |
| Recombinant Human BMP-4 | R&D | 314-BP | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Recombinant human EGF protein | R&D | 236-EG | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| T/C Petridish 100 mm, 240/bx | TPP | 93100 | Plastic ware |
| Transferrin | Sigma | T3705 | Component of epithelial medium for 3D skin organoid |
| Transwell-COL collagen-coated membrane inserts | Corning | CLS3492 | Plastic ware for 3D skin organoid |
| Vitronectin | Life technologies | A14700 | iPSC culture |
| Y-27632 Dihydrochloride | peprotech | 1293823 | iPSC culture |
Referências
- Vincent, J. F., Bogatyreva, O. A., Bogatyrev, N. R., Bowyer, A., Pahl, A. K. Biomimetics: its practice and theory. Journal of The Royal Society Interface. 3 (9), 471-482 (2006).
- Madison, K. C. Barrier function of the skin: “la raison d’etre” of the epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 121 (2), 231-241 (2003).
- Chen, M., Przyborowski, M., Berthiaume, F. Stem cells for skin tissue engineering and wound healing. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 37 (4-5), 399-421 (2009).
- Dixit, S., et al. Immunological challenges associated with artificial skin grafts: available solutions and stem cells in future design of synthetic skin. Journal of Biological Engineering. 11, 49 (2017).
- Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10 (6), 678-684 (2012).
- Yamanaka, S. Pluripotency and nuclear reprogramming. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363 (1500), 2079-2087 (2008).
- Scheiner, Z. S., Talib, S., Feigal, E. G. The potential for immunogenicity of autologous induced pluripotent stem cell-derived therapies. Journal of Biological Chemistry. 289 (8), 4571-4577 (2014).
- Zimmermann, A., Preynat-Seauve, O., Tiercy, J. M., Krause, K. H., Villard, J. Haplotype-based banking of human pluripotent stem cells for transplantation: potential and limitations. Stem Cells and Development. 21 (13), 2364-2373 (2012).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Terasaki, P. I. A brief history of HLA. Immunologic Research. 38 (1-3), 139-148 (2007).
- Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
- Rim, Y. A., et al. Recent progress of national banking project on homozygous HLA-typed induced pluripotent stem cells in South Korea. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 1531-1536 (2018).
- Nakatsuji, N., Nakajima, F., Tokunaga, K. HLA-haplotype banking and iPS cells. Nature Biotechnology. 26 (7), 739-740 (2008).
- Pappas, D. J., et al. Proceedings: human leukocyte antigen haplo-homozygous induced pluripotent stem cell haplobank modeled after the california population: evaluating matching in a multiethnic and admixed population. Stem Cells Translational Medicine. 4 (5), 413-418 (2015).
- Embryoid body formation from human pluripotent stem cells in chemically defined E8 media. StemBook Available from: https://www.stembook.org/node/6632 (2008)
- Kim, Y., et al. Establishment of a complex skin structure via layered co-culture of keratinocytes and fibroblasts derived from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 217 (2018).
- Diecke, S., Jung, S. M., Lee, J., Ju, J. H. Recent technological updates and clinical applications of induced pluripotent stem cells. The Korean Journal of Internal Medicine. 29 (5), 547-557 (2014).
- Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
- Pham, T. L., Nguyen, T. T., Van Bui, A., Nguyen, M. T., Van Pham, P. Fetal heart extract facilitates the differentiation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells into heart muscle precursor cells. Cytotechnology. 68 (4), 645-658 (2016).
- Stecklum, M., et al. Cell differentiation mediated by co-culture of human umbilical cord blood stem cells with murine hepatic cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 51 (2), 183-191 (2015).
- Nam, Y., Rim, Y. A., Ju, J. H. Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (124), e55988 (2017).
- Rim, Y. A., Nam, Y., Ju, J. H. Application of Cord Blood and Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells for Cartilage Regeneration. Cell Transplantation. , (2018).
- Shevde, N. K., Mael, A. A. Techniques in embryoid body formation from human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 946, 535-546 (2013).
- Shamis, Y., et al. iPSC-derived fibroblasts demonstrate augmented production and assembly of extracellular matrix proteins. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 48 (2), 112-122 (2012).
- Bikle, D. D., Xie, Z., Tu, C. L. Calcium regulation of keratinocyte differentiation. Expert Review of Endocrinology & Metabolism. 7 (4), 461-472 (2012).
- Bernstam, L. I., Vaughan, F. L., Bernstein, I. A. Keratinocytes grown at the air-liquid interface. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 22 (12), 695-705 (1986).
- Prunieras, M., Regnier, M., Woodley, D. Methods for cultivation of keratinocytes with an air-liquid interface. Journal of Investigative Dermatology. 81, 28-33 (1983).
- Steven, A. C., Bisher, M. E., Roop, D. R., Steinert, P. M. Biosynthetic pathways of filaggrin and loricrin–two major proteins expressed by terminally differentiated epidermal keratinocytes. Journal of Structural Biology. 104 (1-3), 150-162 (1990).
- Hohl, D., et al. Characterization of human loricrin. Structure and function of a new class of epidermal cell envelope proteins. Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6626-6636 (1991).
- Bern, R., et al. Original and modified technique of tie-over dressing: Method and application in burn patients. Burns. 44 (5), 1357-1360 (2018).
- Joyce, C. W., Joyce, K. M., Kennedy, A. M., Kelly, J. L. The Running Barbed Tie-over Dressing. Plastic and Reconstructive Surgery – Global Open. 2 (4), 137 (2014).
- Wang, C. K., Nelson, C. F., Brinkman, A. M., Miller, A. C., Hoeffler, W. K. Spontaneous cell sorting of fibroblasts and keratinocytes creates an organotypic human skin equivalent. Journal of Investigative Dermatology. 114 (4), 674-680 (2000).
- Yang, R., et al. Generation of folliculogenic human epithelial stem cells from induced pluripotent stem cells. Nature Communications. 5, 3071 (2014).
