코드 혈액 파생에서 3D 피부 Organoid의 생성 유도 만능 줄기 세포
1CiSTEM Laboratory, Catholic Induced Pluripotent Stem Cell (iPSC) Research Center, College of Medicine,The Catholic University of Korea, 2Department of Biomedicine & Health Science, Seoul St. Mary’s Hospital, College of Medicine,The Catholic University of Korea, 3Division of Rheumatology, Department of Internal Medicine, Seoul St. Mary’s Hospital, College of Medicine,The Catholic University of Korea
Summary
우리는 이러한 keratinocytes 및 섬유 아 세포를 사용 하 여 유도 만능 줄기 세포 유래 keratinocytes 및 섬유 아 세포 분화 및 3D 피부 organoid, 생성 하는 방법을 보여 주는 프로토콜을 제안 합니다. 이 프로토콜 humanized 마우스 모델을 생성 하는 추가 단계를 포함 합니다. 여기에 제시 된 기술 피부과 연구를 향상 됩니다.
Abstract
피부는 신체의 가장 큰 기관 이다 하 고 많은 기능을가지고 있다. 피부 물리적 장벽 및 시체의 수호자로 서 역할을 하며 신체 기능을 조절. Biomimetics 모델, 시스템 및 복잡 한 인간의 문제1을 해결 하기 위해 자연의 모방 이다. 피부 biomimetics 생체 외에서 질병 연구 그리고 vivo에서 재생 의학에 대 한 유용한 도구입니다. 인간 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc) 무제한 확산의 특성 있고 3 개의 세균 층을 차별화의 능력. 인간의 Ipsc는 다양 한 기본 세포, 혈액 세포, keratinocytes, 섬유 아 세포 등에서 생성 됩니다. 그 중, 탯 줄 혈액 단 세포 (CBMCs) 수용자 재생 의학의 관점에서 다른 셀 원으로 떠오르고 있다. 셀 뱅킹 시스템에 필수적 이다 인간 백혈구 항 원 (HLA) 입력 하기 때문에 CBMCs는 재생 의학에 유용 합니다. 우리 섬유 아 세포와 keratinocytes CBMC Ipsc의 차별화 및 3D 피부 organoid의 생성을 위한 메서드를 제공합니다. CBMC iPSC 파생 keratinocytes 및 섬유 아 세포 1 차 셀 라인에 유사한 특성이 있다. 3D 피부 organoids는 피부 층에 표 피 레이어 overlaying에 의해 생성 됩니다. 이 3D 피부 organoid, 이식으로 인간 답게 마우스 모델 생성 됩니다. 이 연구는 3 차원 인간의 iPSC 파생 피부 organoid 피부과 연구 생체 외에서 그리고 vivo에서 소설, 대체 도구가 될 수 있습니다 보여줍니다.
Introduction
피부는 신체의 가장 바깥쪽 표면 커버 하 고 내부 장기를 보호 한다. 피부는 병원 체에 대 한 보호, 흡수, 저장 물 등 다양 한 기능, 체온을 조절 하 고 신체를 검출 낭비2. 피부 이식 피부 소스;에 따라 분류 될 수 있다 다른 기증자 로부터 피부를 사용 하 여 이식 이식, 불린다 고 이식 환자 자신의 피부를 사용 하 여 autografts. autograft는 그것의 낮은 거부 위험으로 인해 선호 하는 치료, 피부 생 검은 심한 병 변 가진 환자 또는 피부 세포의 수가 부족에 수행 하기 어렵다. 환자에서 심한 화상, 피부 세포의 수 3 배 큰 부위를 커버 하는 데 필요한 있습니다. 환자의 몸에서 피부 세포의 제한 된 가용성 allogenous 식은 필요한 경우에 발생 합니다. 그것은 일반적으로 약 1 주3후 숙주의 면역 체계에 의해 거부 이후 자가 이식을 수행할 수 있습니다 때까지 일시적으로 이식 사용 됩니다. 환자의 면역 시스템에 의해 거부를 극복 하기 위해 이식 환자4같은 면역 정체성과 소스에서와 야 한다.
인간의 Ipsc는 줄기 세포 치료5셀의 신흥 소스입니다. 인간의 Ipsc OCT4, SOX2, Klf4, 및 c-Myc6등 재활 요소를 사용 하 여 신체 세포에서 생성 됩니다. 인간의 Ipsc를 사용 하 여 배아 줄기 세포 (ESCs)7,8의 윤리 문제와 면역 극복. 인간의 Ipsc pluripotency 있고 3 개의 세균 층9으로 분화 할 수 있다. HLA, 재생 의학에 중요 한 요인의 존재는 면역 반응과 거부10의 가능성을 결정합니다. 환자 파생 Ipsc 사용 하 여 셀 소스 제한 및 면역 시스템의 문제를 해결합니다. CBMCs는 또한 재생 의학11에 대 한 대체 셀 원본으로 나왔다. 필수 HLA 타이핑, CBMC 은행 중 발생 하는 연구와 이식에 대 한 쉽게 사용할 수 있습니다. 더, homozygous HLA 형 Ipsc 널리 다양 한 환자12에 적용할 수 있습니다. CBMC iPSC 은행 소설 및 세포 치료 및 재생 의학 allogenic12,,1314에 대 한 효율적인 전략 이다. 이 연구에서 우리는 CBMC-Ipsc, keratinocytes 및 섬유 아 세포로 분화를 사용 하 고 층 화 3D 피부 레이어를 생성. 이 연구에서 결과 3D 피부 CBMC iPSC 파생 organoid 생체 외에서 그리고 vivo에서 피부과 연구를 위한 새로운 도구는 것이 좋습니다.
Protocol
동물 관련 된 모든 절차는 실험실 동물 복지 행위, 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드에 따라 수행 했다 그리고 기관 동물 관리에서 지침 및 설치류 실험에 대 한 정책을 제공 하 고 한국 가톨릭 대학의 학부의 위원회 (IACUC)를 사용 합니다. 연구 프로토콜은 가톨릭 대학교의 한국 (CUMC-2018-0191-01)의 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었다. Songeui 캠퍼스 2017 및 취득 협회 평가 대 한 식품 및 의약?…
Representative Results
피부는 표 피와 진 피, 대부분의 경우, 구성 됩니다. Keratinocytes는 주요 세포 유형의 표 피, 고 섬유 아 세포는 진 피의 주요 셀 형식. Keratinocyte 차별화의 체계는 그림 1에 표시 됩니다. CBMC iPCSc vitronectin 코팅 접시 (그림 1B)에 유지 되었다. 이 연구에서 우리가 EB 형성을 사용 하 여 섬유 아 세포와 keratinocytes CBMC Ipsc 분화. EBs는 교수?…
Discussion
인간의 Ipsc 맞춤된 재생 의료17에 대 한 새로운 대안 제안 되어 있다. 맞춤된 Ipsc 환자 파생 질병 모델링, 약물 검사, 및 자가 이식18,19사용할 수 있는 환자 특성을 반영 합니다. 환자 파생 Ipsc의 사용 또한 1 차 셀, 적절 한 셀 숫자 및 면역 반응5,,1719의 부족에 관한 문?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 건강, 복지 및 가족 업무, 한국 공화국 (H16C2177, H18C1178)에 대 한 한국 의료 기술 R & D 프로젝트, 정부에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Adenine | Sigma | A2786 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| AggreWell Medium (EB formation medium) | STEMCELL | 05893 | EB formation |
| Anti-Fibronectin antibody | abcam | ab23750 | Fibroblast marker |
| Anti-KRT14 antibody | abcam | ab7800 | Keratinocyte marker |
| Anti-Loricrin antibody | abcam | ab85679 | Stratum corneum marker |
| Anti-p63 antibody | abcam | ab124762 | Keratinocyte marker |
| Anti-Vimentin antibody | Santa cruz | sc-7558 | Fibroblast marker |
| BAND AID FLEXIBLE FABRIC | Johnson & Johnson | – | Bandage |
| Basement membrane matrix (Matrigel) | BD | 354277 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| BLACK SILK suture | AILEEE | SK617 | Skin graft |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | Component of epithelial medium for 3D skin organoid |
| Collagen type I | BD | 354236 | 3D skin organoid |
| Collagen type IV | Santa-cruz | sc-29010 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Defined keratinocyte-Serum Free Medium | Gibco | 10744-019 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11995065 | Component of differentiation medium |
| DMEM/F12 Medium | Gibco | 11330-032 | Component of differentiation medium |
| Essential 8 medium | Gibco | A1517001 | iPSC medium |
| FBS, Qualified | Corning | 35-015-CV | Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte |
| Glutamax Supplement | Gibco | 35050061 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| Insulin | Invtrogen | 12585-014 | Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte |
| Iris standard curved scissor | Professional | PC-02.10 | Surgical instrument |
| Keratinocyte Serum Free Medium | Gibco | 17005-042 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| L-ascorbic acid 2-phosphata sesquimagnesium salt hydrate | Sigma | A8960 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| MEM Non-Essential Amino Acid | Gibco | 1140050 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| Meriam Forceps Thumb 16 cm | HIROSE | HC 2265-1 | Surgical instrument |
| NOD.CB17-Prkdc SCID/J | The Jackson Laboratory | 001303 | Mice strain for skin graft |
| Petri dish 90 mm | Hyundai Micro | H10090 | Plastic ware |
| Recombinant Human BMP-4 | R&D | 314-BP | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Recombinant human EGF protein | R&D | 236-EG | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| T/C Petridish 100 mm, 240/bx | TPP | 93100 | Plastic ware |
| Transferrin | Sigma | T3705 | Component of epithelial medium for 3D skin organoid |
| Transwell-COL collagen-coated membrane inserts | Corning | CLS3492 | Plastic ware for 3D skin organoid |
| Vitronectin | Life technologies | A14700 | iPSC culture |
| Y-27632 Dihydrochloride | peprotech | 1293823 | iPSC culture |
Referências
- Vincent, J. F., Bogatyreva, O. A., Bogatyrev, N. R., Bowyer, A., Pahl, A. K. Biomimetics: its practice and theory. Journal of The Royal Society Interface. 3 (9), 471-482 (2006).
- Madison, K. C. Barrier function of the skin: “la raison d’etre” of the epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 121 (2), 231-241 (2003).
- Chen, M., Przyborowski, M., Berthiaume, F. Stem cells for skin tissue engineering and wound healing. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 37 (4-5), 399-421 (2009).
- Dixit, S., et al. Immunological challenges associated with artificial skin grafts: available solutions and stem cells in future design of synthetic skin. Journal of Biological Engineering. 11, 49 (2017).
- Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10 (6), 678-684 (2012).
- Yamanaka, S. Pluripotency and nuclear reprogramming. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363 (1500), 2079-2087 (2008).
- Scheiner, Z. S., Talib, S., Feigal, E. G. The potential for immunogenicity of autologous induced pluripotent stem cell-derived therapies. Journal of Biological Chemistry. 289 (8), 4571-4577 (2014).
- Zimmermann, A., Preynat-Seauve, O., Tiercy, J. M., Krause, K. H., Villard, J. Haplotype-based banking of human pluripotent stem cells for transplantation: potential and limitations. Stem Cells and Development. 21 (13), 2364-2373 (2012).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Terasaki, P. I. A brief history of HLA. Immunologic Research. 38 (1-3), 139-148 (2007).
- Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
- Rim, Y. A., et al. Recent progress of national banking project on homozygous HLA-typed induced pluripotent stem cells in South Korea. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 1531-1536 (2018).
- Nakatsuji, N., Nakajima, F., Tokunaga, K. HLA-haplotype banking and iPS cells. Nature Biotechnology. 26 (7), 739-740 (2008).
- Pappas, D. J., et al. Proceedings: human leukocyte antigen haplo-homozygous induced pluripotent stem cell haplobank modeled after the california population: evaluating matching in a multiethnic and admixed population. Stem Cells Translational Medicine. 4 (5), 413-418 (2015).
- Embryoid body formation from human pluripotent stem cells in chemically defined E8 media. StemBook Available from: https://www.stembook.org/node/6632 (2008)
- Kim, Y., et al. Establishment of a complex skin structure via layered co-culture of keratinocytes and fibroblasts derived from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 217 (2018).
- Diecke, S., Jung, S. M., Lee, J., Ju, J. H. Recent technological updates and clinical applications of induced pluripotent stem cells. The Korean Journal of Internal Medicine. 29 (5), 547-557 (2014).
- Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
- Pham, T. L., Nguyen, T. T., Van Bui, A., Nguyen, M. T., Van Pham, P. Fetal heart extract facilitates the differentiation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells into heart muscle precursor cells. Cytotechnology. 68 (4), 645-658 (2016).
- Stecklum, M., et al. Cell differentiation mediated by co-culture of human umbilical cord blood stem cells with murine hepatic cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 51 (2), 183-191 (2015).
- Nam, Y., Rim, Y. A., Ju, J. H. Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (124), e55988 (2017).
- Rim, Y. A., Nam, Y., Ju, J. H. Application of Cord Blood and Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells for Cartilage Regeneration. Cell Transplantation. , (2018).
- Shevde, N. K., Mael, A. A. Techniques in embryoid body formation from human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 946, 535-546 (2013).
- Shamis, Y., et al. iPSC-derived fibroblasts demonstrate augmented production and assembly of extracellular matrix proteins. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 48 (2), 112-122 (2012).
- Bikle, D. D., Xie, Z., Tu, C. L. Calcium regulation of keratinocyte differentiation. Expert Review of Endocrinology & Metabolism. 7 (4), 461-472 (2012).
- Bernstam, L. I., Vaughan, F. L., Bernstein, I. A. Keratinocytes grown at the air-liquid interface. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 22 (12), 695-705 (1986).
- Prunieras, M., Regnier, M., Woodley, D. Methods for cultivation of keratinocytes with an air-liquid interface. Journal of Investigative Dermatology. 81, 28-33 (1983).
- Steven, A. C., Bisher, M. E., Roop, D. R., Steinert, P. M. Biosynthetic pathways of filaggrin and loricrin–two major proteins expressed by terminally differentiated epidermal keratinocytes. Journal of Structural Biology. 104 (1-3), 150-162 (1990).
- Hohl, D., et al. Characterization of human loricrin. Structure and function of a new class of epidermal cell envelope proteins. Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6626-6636 (1991).
- Bern, R., et al. Original and modified technique of tie-over dressing: Method and application in burn patients. Burns. 44 (5), 1357-1360 (2018).
- Joyce, C. W., Joyce, K. M., Kennedy, A. M., Kelly, J. L. The Running Barbed Tie-over Dressing. Plastic and Reconstructive Surgery – Global Open. 2 (4), 137 (2014).
- Wang, C. K., Nelson, C. F., Brinkman, A. M., Miller, A. C., Hoeffler, W. K. Spontaneous cell sorting of fibroblasts and keratinocytes creates an organotypic human skin equivalent. Journal of Investigative Dermatology. 114 (4), 674-680 (2000).
- Yang, R., et al. Generation of folliculogenic human epithelial stem cells from induced pluripotent stem cells. Nature Communications. 5, 3071 (2014).
Citar este artigo
Kim, Y., Ju, J. H. Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (146), e59297, doi:10.3791/59297 (2019).