Generation av 3D hud Organoid från sladd blod-derived inducerade pluripotenta stamceller
Summary
Vi föreslår ett protokoll som visar hur att skilja inducerade pluripotenta stamceller-derived keratinocyter och fibroblaster och generera en 3D hud organoid, använda dessa keratinocyter och fibroblaster. Detta protokoll innehåller ytterligare ett steg för att generera en humaniserade möss modell. Tekniken presenteras här kommer förbättra Dermatologisk forskning.
Abstract
Huden är kroppens största organ och har många funktioner. Huden fungerar som en fysisk barriär och beskyddare av kroppen och reglerar kroppsliga funktioner. Biomimetik är imitation av de modeller, system och delar av naturen i syfte att lösa komplexa mänskliga problem1. Huden Biomimetik är ett användbart verktyg för in vitro-Sjukdomforskning och Invivo regenerativ medicin. Mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) har kännetecken av obegränsad proliferation och differentiering förmåga att tre groddar lager. Mänskliga iPSCs genereras från olika primära celler, blodkroppar, keratinocyter, fibroblaster och mer. Bland dem, har mononukleära celler navelsträngsblod (CBMCs) kommit att bli en alternativ cell källa från perspektiv av allogena regenerativ medicin. CBMCs är användbara i regenerativ medicin eftersom humant leukocyt antigen (HLA) att skriva är nödvändigt till cellen banksystemet. Vi tillhandahåller en metod för differentiering av CBMC-iPSCs till keratinocyter och fibroblaster och för generering av en 3D hud organoid. CBMC-iPSC-härledda keratinocyter och fibroblaster har liknande egenskaper som en primär cell fodrar. De 3D hud organoids genereras genom att lägga till en epidermal lager på ett dermal lager. Genom omplantering denna 3D hud organoid, genereras en humaniserade möss modell. Denna studie visar att en 3D människohud som iPSC-derived organoid kan vara en roman, alternativa verktyg för Dermatologisk forskning in vitro- och in vivo.
Introduction
Huden täcker den yttersta ytan av kroppen och skyddar inre organ. Huden har olika funktioner, inklusive skydda mot patogener, absorbera och lagra vatten, reglera kroppstemperaturen och utsöndra kroppen avfall2. Hudtransplantation kan klassificeras beroende på källan som huden; ympkvistar använder hud från en annan givare kallas organtransplantationer och ympkvistar använder patientens egen huden är delad. Även om en autograft är den föredragna behandlingen på grund av dess låga avvisande risk, är hud biopsier svåra att utföra på patienter med svåra skador eller ett otillräckligt antal hudceller. Hos patienter med svåra brännskador är tre gånger antalet hudceller nödvändiga för att täcka stora områden. Den begränsade tillgången av hudceller från en patients kropp resulterar i situationer där allogenous transplantation är nödvändigt. En transplantatavstötning används tillfälligt tills autolog transplantation kan utföras eftersom det är oftast avvisas av värdens immunförsvar efter cirka 1 vecka3. För att övervinna förkastande av patientens immunförsvar, måste transplantat komma från en källa med samma immun identitet som den tålmodiga4.
Mänskliga iPSCs är en framväxande källa av celler för stamceller terapi5. Mänskliga iPSCs genereras från kroppsceller, använda omplanering faktorer såsom OCT4, SOX2, Klf4 och c-Myc6. Använder mänskliga iPSCs övervinner de etiska och immunologiska problem av embryonala stamceller (råden)7,8. Mänskliga iPSCs har pluripotency och kan differentieras till tre groddar lager9. Förekomst av HLA, en kritisk faktor inom regenerativ medicin, avgör immunsvaret och möjligheten till förkastande10. Användning av patientderiverade iPSCs löser problemen med cell-source begränsning och immunsystemet förkastande. CBMCs har också dykt upp som en alternativ cell källa för regenerativ medicin11. Obligatoriska HLA maskinskrivning, som uppstår under återstående bank, kan enkelt användas för forskning och transplantation. Ytterligare, homozygot HLA-typ iPSCs kan ofta gälla olika patienter12. En CBMC-iPSC bank är en ny och effektiv strategi för cellterapi och prövningar regenerativ medicin12,13,14. I denna studie, vi använder CBMC-iPSCs, differentierade keratinocyter och fibroblaster, och generera stratifierat 3D hudlagren. Resultaten från denna studie tyder på att en CBMC-iPSC-härledda 3D hud organoid är ett nytt verktyg för in vitro- och in vivo Dermatologisk forskning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mänskliga iPSCs har föreslagits som ett nytt alternativ för personlig regenerativ medicin17. Patientderiverade personlig iPSCs speglar patientens egenskaper som kan användas för sjukdom modellering, drogkontroll och autolog transplantation18,19. Användning av patientderiverade iPSCs kan också övervinna problemen när det gäller primära celler, en brist på adekvat cell nummer och immunreaktioner5,</su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av ett bidrag från Korea hälso-och sjukvård teknik R & D projekt, ministeriet för hälsa, välfärd och familjefrågor, Sydkorea (H16C2177, H18C1178).
Materials
| Adenine | Sigma | A2786 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| AggreWell Medium (EB formation medium) | STEMCELL | 05893 | EB formation |
| Anti-Fibronectin antibody | abcam | ab23750 | Fibroblast marker |
| Anti-KRT14 antibody | abcam | ab7800 | Keratinocyte marker |
| Anti-Loricrin antibody | abcam | ab85679 | Stratum corneum marker |
| Anti-p63 antibody | abcam | ab124762 | Keratinocyte marker |
| Anti-Vimentin antibody | Santa cruz | sc-7558 | Fibroblast marker |
| BAND AID FLEXIBLE FABRIC | Johnson & Johnson | – | Bandage |
| Basement membrane matrix (Matrigel) | BD | 354277 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| BLACK SILK suture | AILEEE | SK617 | Skin graft |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | Component of epithelial medium for 3D skin organoid |
| Collagen type I | BD | 354236 | 3D skin organoid |
| Collagen type IV | Santa-cruz | sc-29010 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Defined keratinocyte-Serum Free Medium | Gibco | 10744-019 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11995065 | Component of differentiation medium |
| DMEM/F12 Medium | Gibco | 11330-032 | Component of differentiation medium |
| Essential 8 medium | Gibco | A1517001 | iPSC medium |
| FBS, Qualified | Corning | 35-015-CV | Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte |
| Glutamax Supplement | Gibco | 35050061 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| Insulin | Invtrogen | 12585-014 | Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte |
| Iris standard curved scissor | Professional | PC-02.10 | Surgical instrument |
| Keratinocyte Serum Free Medium | Gibco | 17005-042 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| L-ascorbic acid 2-phosphata sesquimagnesium salt hydrate | Sigma | A8960 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| MEM Non-Essential Amino Acid | Gibco | 1140050 | Component of differentiation medium for fibroblast |
| Meriam Forceps Thumb 16 cm | HIROSE | HC 2265-1 | Surgical instrument |
| NOD.CB17-Prkdc SCID/J | The Jackson Laboratory | 001303 | Mice strain for skin graft |
| Petri dish 90 mm | Hyundai Micro | H10090 | Plastic ware |
| Recombinant Human BMP-4 | R&D | 314-BP | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Recombinant human EGF protein | R&D | 236-EG | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
| T/C Petridish 100 mm, 240/bx | TPP | 93100 | Plastic ware |
| Transferrin | Sigma | T3705 | Component of epithelial medium for 3D skin organoid |
| Transwell-COL collagen-coated membrane inserts | Corning | CLS3492 | Plastic ware for 3D skin organoid |
| Vitronectin | Life technologies | A14700 | iPSC culture |
| Y-27632 Dihydrochloride | peprotech | 1293823 | iPSC culture |
Referências
- Vincent, J. F., Bogatyreva, O. A., Bogatyrev, N. R., Bowyer, A., Pahl, A. K. Biomimetics: its practice and theory. Journal of The Royal Society Interface. 3 (9), 471-482 (2006).
- Madison, K. C. Barrier function of the skin: “la raison d’etre” of the epidermis. Journal of Investigative Dermatology. 121 (2), 231-241 (2003).
- Chen, M., Przyborowski, M., Berthiaume, F. Stem cells for skin tissue engineering and wound healing. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 37 (4-5), 399-421 (2009).
- Dixit, S., et al. Immunological challenges associated with artificial skin grafts: available solutions and stem cells in future design of synthetic skin. Journal of Biological Engineering. 11, 49 (2017).
- Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10 (6), 678-684 (2012).
- Yamanaka, S. Pluripotency and nuclear reprogramming. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363 (1500), 2079-2087 (2008).
- Scheiner, Z. S., Talib, S., Feigal, E. G. The potential for immunogenicity of autologous induced pluripotent stem cell-derived therapies. Journal of Biological Chemistry. 289 (8), 4571-4577 (2014).
- Zimmermann, A., Preynat-Seauve, O., Tiercy, J. M., Krause, K. H., Villard, J. Haplotype-based banking of human pluripotent stem cells for transplantation: potential and limitations. Stem Cells and Development. 21 (13), 2364-2373 (2012).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Terasaki, P. I. A brief history of HLA. Immunologic Research. 38 (1-3), 139-148 (2007).
- Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
- Rim, Y. A., et al. Recent progress of national banking project on homozygous HLA-typed induced pluripotent stem cells in South Korea. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 1531-1536 (2018).
- Nakatsuji, N., Nakajima, F., Tokunaga, K. HLA-haplotype banking and iPS cells. Nature Biotechnology. 26 (7), 739-740 (2008).
- Pappas, D. J., et al. Proceedings: human leukocyte antigen haplo-homozygous induced pluripotent stem cell haplobank modeled after the california population: evaluating matching in a multiethnic and admixed population. Stem Cells Translational Medicine. 4 (5), 413-418 (2015).
- Embryoid body formation from human pluripotent stem cells in chemically defined E8 media. StemBook Available from: https://www.stembook.org/node/6632 (2008)
- Kim, Y., et al. Establishment of a complex skin structure via layered co-culture of keratinocytes and fibroblasts derived from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 217 (2018).
- Diecke, S., Jung, S. M., Lee, J., Ju, J. H. Recent technological updates and clinical applications of induced pluripotent stem cells. The Korean Journal of Internal Medicine. 29 (5), 547-557 (2014).
- Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
- Pham, T. L., Nguyen, T. T., Van Bui, A., Nguyen, M. T., Van Pham, P. Fetal heart extract facilitates the differentiation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells into heart muscle precursor cells. Cytotechnology. 68 (4), 645-658 (2016).
- Stecklum, M., et al. Cell differentiation mediated by co-culture of human umbilical cord blood stem cells with murine hepatic cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 51 (2), 183-191 (2015).
- Nam, Y., Rim, Y. A., Ju, J. H. Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (124), e55988 (2017).
- Rim, Y. A., Nam, Y., Ju, J. H. Application of Cord Blood and Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells for Cartilage Regeneration. Cell Transplantation. , (2018).
- Shevde, N. K., Mael, A. A. Techniques in embryoid body formation from human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 946, 535-546 (2013).
- Shamis, Y., et al. iPSC-derived fibroblasts demonstrate augmented production and assembly of extracellular matrix proteins. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 48 (2), 112-122 (2012).
- Bikle, D. D., Xie, Z., Tu, C. L. Calcium regulation of keratinocyte differentiation. Expert Review of Endocrinology & Metabolism. 7 (4), 461-472 (2012).
- Bernstam, L. I., Vaughan, F. L., Bernstein, I. A. Keratinocytes grown at the air-liquid interface. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 22 (12), 695-705 (1986).
- Prunieras, M., Regnier, M., Woodley, D. Methods for cultivation of keratinocytes with an air-liquid interface. Journal of Investigative Dermatology. 81, 28-33 (1983).
- Steven, A. C., Bisher, M. E., Roop, D. R., Steinert, P. M. Biosynthetic pathways of filaggrin and loricrin–two major proteins expressed by terminally differentiated epidermal keratinocytes. Journal of Structural Biology. 104 (1-3), 150-162 (1990).
- Hohl, D., et al. Characterization of human loricrin. Structure and function of a new class of epidermal cell envelope proteins. Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6626-6636 (1991).
- Bern, R., et al. Original and modified technique of tie-over dressing: Method and application in burn patients. Burns. 44 (5), 1357-1360 (2018).
- Joyce, C. W., Joyce, K. M., Kennedy, A. M., Kelly, J. L. The Running Barbed Tie-over Dressing. Plastic and Reconstructive Surgery – Global Open. 2 (4), 137 (2014).
- Wang, C. K., Nelson, C. F., Brinkman, A. M., Miller, A. C., Hoeffler, W. K. Spontaneous cell sorting of fibroblasts and keratinocytes creates an organotypic human skin equivalent. Journal of Investigative Dermatology. 114 (4), 674-680 (2000).
- Yang, R., et al. Generation of folliculogenic human epithelial stem cells from induced pluripotent stem cells. Nature Communications. 5, 3071 (2014).
