Studere normale vævs stråling effekter ved hjælp af ekstracellulære matrix Hydrogels
Summary
Denne protokol præsenterer en metode til decellularisering og efterfølgende hydrogel dannelse af murine bryst fedt puder efter ex vivo bestråling.
Abstract
Stråling er en terapi for patienter med tredobbelt negativ brystkræft. Virkningen af stråling på den ekstracellulære matrix (ECM) af sundt brystvæv og dets rolle i lokal gentagelse på den primære tumor site er ukendt. Her præsenterer vi en metode til decellularization, lyofilisering, og fabrikation af ECM silicagelrogeler afledt af murine bryst fedt puder. Resultaterne er præsenteret på effektiviteten af decellularization proces, og rheologiske parametre blev vurderet. Gfp-og luciferase-mærkede brystkræft celler indkapslet i silicagelrogeler viste en stigning i spredningen i bestrålede silicagelrogeler. Endelig, phalloidin konjugat farvning blev anvendt til at visualisere cytoskelet organisation af indkapslede tumorceller. Vores mål er at præsentere en metode til opdigte silicagelrogeler til in vitro-undersøgelse, der efterligner in vivo brystvæv miljø og dets reaktion på stråling for at studere tumor celle adfærd.
Introduction
Kræft er karakteriseret ved overskydende spredning af celler, der kan unddrage apoptose og også metastaserer til fjerntliggende steder1. Brystkræft er en af de mest almindeligt forekommende former blandt kvinder i USA, med en anslået 266.000 nye tilfælde og 40.000 dødsfald i 20182. En særlig aggressiv og svær at behandle subtype er tredobbelt negativ brystkræft (TNBC), som mangler østrogen receptor (ER), progesteron receptor (PR), og human epidermal vækstfaktor (HER2). Strålebehandling er almindeligt anvendt i brystkræft at eliminere resterende tumorceller efter lumpectomy, men over 13% af TNBC patienter stadig oplever gentagelse på den primære tumor site3.
Det er kendt, at strålebehandling er effektiv til at afbøde metastase og gentagelse, fordi kombinationen af lumpektomi og stråling resulterer i samme langsigtede overlevelse som mastektomi4. Men, det er for nylig blevet påvist, at strålebehandling er forbundet med lokal gentagelse til den primære tumor site i immunkompromitterede indstillinger5,6. Også, det er velkendt, at stråling ændrer den ekstracellulære matrix (ECM) af normale væv ved inducerende fibrose7. Derfor er det vigtigt at forstå den rolle, stråling-induceret ECM ændringer i dikterer tumor celle adfærd.
Decellularized væv har været anvendt som in vitro-modeller til at studere sygdom8,9. Disse decellularized væv bevare ECM sammensætning og rekapitulate komplekset in vivo ECM. Denne decellularized væv ECM kan yderligere behandles og fordøjet til at danne rekonstituerede ECM silicagelrogeler, der kan bruges til at studere cellevækst og funktion10,11. For eksempel, injicerbare silicagelrogeler afledt af decellularized humant lipoaspirat og fra myokardievæv tjente som ikke-invasive metoder til vævsteknik, og en hydrogel afledt af svin lungevævet blev udnyttet som en in vitro metode til testning mesenchymal stamcelle fastgørelse og levedygtighed12,13,14. Virkningen af normale vævs stråling skader på ECM egenskaber, dog, er ikke blevet undersøgt.
Hydrogels afledt af ECM har det største potentiale for in vitro-undersøgelse af in vivo fænomener. Flere andre materialer er blevet undersøgt, herunder kollagen, fibrin, og matrigel, men det er vanskeligt at syntetisk rekapitulere sammensætningen af ECM13. En fordel ved at bruge ECM-afledte silicagelrogeler er, at ECM indeholder de nødvendige proteiner og vækstfaktorer for en bestemt væv14,15. Bestråling af normalt væv under lumpektomi forårsager betydelige ændringer i ECM, og ECM-afledte silicagelrogeler kan bruges til at studere denne effekt in vitro. Denne metode kan føre til mere komplekse og mere præcise in vitro-modeller af sygdom.
I denne undersøgelse, vi udsat murine bryst fat Pads (MFP’er) til stråling ex vivo. Mfp”erne var decellularized og lavet til præ-gel opløsning. Hydrogels blev dannet med indlejrede 4T1 celler, en murine TNBC cellelinje. De rheologiske egenskaber af hydrogel materialet blev undersøgt, og tumor celle dynamik blev evalueret inden for hydrogels. Hydrogels fremstillet af bestrålede MFP’er forbedret tumor celle spredning. Fremtidige undersøgelser vil indarbejde andre celletyper til at studere celle-celle interaktioner i forbindelse med kræft recidiv efter behandling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne metode til hydrogel dannelse er i høj grad afhængig af mængden af start vævet. Murine MFP’er er små, og den decellularization proces resulterer i en betydelig reduktion af materiale (tabel 1). Processen kan gentages med flere MFP’er for at øge det endelige udbytte. Fræsning er et andet vigtigt skridt, der kan føre til tab af materiale. Andre har vist succes med en Cryogen mølle, men denne protokol er baseret på fræsning via en håndholdt mørtel og elektrisk boremaskine med en Pestle fas…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Dr. Laura L. Bronsart for at levere GFP-og luciferase-4T1 celler, Dr. Edward L. LaGory for rådgivning om 1-([4-(Xylylazo) xylyl] AZO) -2-naphthol farvning, Dr. Craig L. Duvall for IVIS og lyophilizer brug, og Dr. Scott A. Guelcher for rheometer Bruge. Denne forskning blev finansielt støttet af NIH Grant #R00CA201304.
Materials
| 10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot | VWR | 16004-128 | – |
| 2-methylbutane | Alfa Aesar | 19387 | – |
| AR 2000ex Rheometer | TA Instruments | 10D4335 | rheometer |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A1933-25G | – |
| calcein acetoxymethyl (calcein AM) | Molecular Probes, Inc. | C1430 | – |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth Chemistry & Biology | L-8820 | (S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt |
| DPX Mountant for Histology | Sigma-Aldrich | 06522-500ML | – |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Gibco | 14040133 | – |
| Eosin-Y with Phloxine | Richard-Allan Scientific | 71304 | eosin |
| ethidium homodimer | Molecular Probes, Inc. | E1169 | ethidium homodimer-1 (EthD-1) |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926-500ML | – |
| Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | cryostat embedding medium |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | aqueous based mounting medium |
| FreeZone 4.5 | Labconco | 7751020 | lyophilizer |
| Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Scientific | 62249 | blue fluorescent dye |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | – |
| IVIS Lumina III | PerkinElmer | CLS136334 | bioluminescence imaging system |
| Kimtech Science Kimwipes | Kimberly Clark | delicate task wipes | |
| n-Propanol (Peroxide-Free/Sequencing), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1130-500 | – |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625-25G | 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol |
| OPS Diagnostics CryoGrinder | OPS Diagnostics, LLC | CG-08-02 | – |
| PBS (10X), pH 7.4 | Quality Biological, Inc. | 119-069-151 | Phosphate-buffered saline |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | – |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-5G | pepsin |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | 77240-100ML | – |
| Phalloidin-iFluor 594 Reagent (ab176757) | abcam | ab176757 | phalloidin conjugate |
| Propylene glycol | Sigma-Aldrich | W294004-1KG-K | – |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Bluing Reagent | Richard-Allan Scientific | 7301L | bluing agent |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211 | Richard-Allan Scientific | 7211 | – |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | – |
| Sodium deoxycholate, 98% | Frontier Scientific | JK559522 | deoxycholic acid |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | – |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200-056 | – |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 4 | Whatman | 1004-110 | grade 4 qualitative filter paper |
| Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X5-4 | – |
Referências
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
- Lowery, A. J., Kell, M. R., Glynn, R. W., Kerin, M. J., Sweeney, K. J. Locoregional recurrence after breast cancer surgery: a systematic review by receptor phenotype. Breast Cancer Research and Treatment. 133 (3), 831-841 (2012).
- Miller, K. D., et al. Cancer treatment and survivorship statistics, 2016. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 66 (4), 271-289 (2016).
- Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy. Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).
- Rafat, M., Aguilera, T. A., Vilalta, M., Bronsart, L. L., Soto, L. A., von Eyben, R., Golla, M. A., Ahrari, Y., Melemenidis, S., Afghahi, A., Jenkins, M. J., Kurian, A. W., Horst, K. C., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence Following Radiation Therapy in Immunosuppressed Patients. Cancer Res. 75 (15), 4241-4252 (2018).
- Haubner, F., Ohmann, E., Pohl, F., Strutz, J., Gassner, H. G. Wound healing after radiation therapy: Review of the literature. Radiation Oncology. 7 (1), 1-9 (2012).
- Beachley, V. Z., et al. Tissue matrix arrays for high throughput screening and systems analysis of cell function. Nature Methods. 12 (12), 1197-1204 (2015).
- Tian, X., et al. Organ-specific metastases obtained by culturing colorectal cancer cells on tissue-specific decellularized scaffolds. Nature Biomedical Engineering. 2 (6), 443-452 (2018).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Hinderer, S., Layland, S. L., Schenke-Layland, K. ECM and ECM-like materials — Biomaterials for applications in regenerative medicine and cancer therapy. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 260-269 (2016).
- Young, D. A., Ibrahim, D. O., Hu, D., Christman, K. L. Injectable hydrogel scaffold from decellularized human lipoaspirate. Acta Biomaterialia. 7 (3), 1040-1049 (2011).
- Singelyn, J. M., Christman, K. L., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).
- Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).
- Bonvillain, R. W., et al. A Nonhuman Primate Model of Lung Regeneration: Detergent-Mediated Decellularization and Initial In Vitro Recellularization with Mesenchymal Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 18 (23-24), 2437-2452 (2012).
- Brown, B. N., et al. Comparison of Three Methods for the Derivation of a Biologic Scaffold Composed of Adipose Tissue Extracellular Matrix. Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (4), 411-421 (2011).
- Link, P. A., Pouliot, R. A., Mikhaiel, N. S., Young, B. M., Heise, R. L. Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (119), 1-9 (2017).
- Massensini, A. R., et al. Concentration-dependent rheological properties of ECM hydrogel for intracerebral delivery to a stroke cavity. Acta Biomaterialia. 27, 116-130 (2015).
- Mierke, C. T., Frey, B., Fellner, M., Herrmann, M., Fabry, B. Integrin 5 1 facilitates cancer cell invasion through enhanced contractile forces. Journal of Cell Science. 124 (3), 369-383 (2011).
- Ahmadzadeh, H., et al. Modeling the two-way feedback between contractility and matrix realignment reveals a nonlinear mode of cancer cell invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), E1617-E1626 (2017).
