Este trabalho apresenta um protocolo para o estabelecimento de uma cultura de suspensão celular derivada de folhas de chá (Camellia sinensis L.) que podem ser utilizadas para estudar o metabolismo de compostos externos que podem ser tomados por toda a planta, como inseticidas.
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Artigo de método
Estudo sobre o metabolismo de seis inseticidas sistêmicas em uma cultura de suspensão celular recém-estabelecida derivada do chá (Camellia sinensis L.) Folhas
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Uma plataforma para estudar o metabolismo do insecticida usando in vitro os tecidos da planta de chá foi desenvolvida. As folhas das plântulas de chá estéreis foram induzidas para formar calo solto nos meios basais de Murashige e Skoog (MS) com os hormônios vegetais 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D, 1,0 mg L-1) e CINETINA (KT, 0,1 mg l-1). Callus formado após 3 ou 4 rodadas de subculturação, cada um com duração de 28 dias. O calo frouxo (aproximadamente 3 g) foi inoculado então em meios líquidos B5 que contêm os mesmos hormônios de planta e foi cultivado em uma incubadora de agitação (120 rpm) no escuro em 25 ± 1 ° c. Após 3 − 4 subculturas, uma suspensão da pilha derivada da folha do chá foi estabelecida em uma relação da subcultura que varia entre 1:1 e 1:2 (líquido da mãe da suspensão: meio fresco). Usando esta plataforma, seis insecticidas (5 μg mL-1 cada Thiamethoxam, Imidacloprid, Acetamiprid, imidaclothiz, dimethoate, e omethoate) foram adicionados na cultura folha-derivada do chá da suspensão da pilha. O metabolismo dos inseticidas foi rastreado usando cromatografia líquida e cromatografia gasosa. Para validar a utilidade da cultura da suspensão da pilha de chá, os metabolitos do tiametoxam e do dimetoato atuais em culturas de pilha tratadas e em plantas intactas foram comparados usando a espectrometria maciça. Em culturas tratadas da pilha de chá, sete Metabolites de tiametoxam e dois Metabolites do dimetoato foram encontrados, quando em plantas intactas tratadas, somente dois Metabolites do tiametoxam e um do dimetoato foram encontrados. O uso de uma suspensão celular simplificou a análise metabólica em comparação com o uso de plantas de chá intactas, especialmente para uma matriz difícil, como o chá.
Introdução
O chá é uma das bebidas não alcoólicas mais consumidas no mundo1,2. O chá é produzido a partir das folhas e gemas do Woodyperene Camellia sinensis L. as plantas de chá são cultivadas em vastas plantações e são suscetíveis a numerosas pragas de insetos3,4. Os insecticidas do organophosphorus e do neonicotinóides são usados frequentemente como insecticidas sistemáticas5 para proteger plantas de chá das pragas tais como whiteflies, funis da folha, e alguma espécie do lepidóptero6,7
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Protocolo
1. cultura do calo do chá
Nota: as folhas estéreis foram derivadas de linhas de plânteria cultivadas in vitro, desenvolvidas pela primeira vez no grupo de pesquisa17. Todos os procedimentos até a seção 5 foram conduzidos em uma capa estéril do fluxo laminar, à exceção do tempo da cultura em uma incubadora.
- Ajuste o pH dos dois meios (Murashige e Skoog [MS] meio basal e o meio líquido B5 de Gamborg) para 5,8 antes de autoclavagem (121 ° c, 20 min).
- Corte ao longo da veia média de uma folha estéril usando tesouras e, em seguida, subdivida cada metade em pequenos pedaços de cerca de 0,3 cm x 0,3 cm e....
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Resultados
A indução de calo de folhas colhidas de árvores de chá cultivadas em campo e de folhas excisadas de plântulas de chá cultivadas in vitro em ambiente estéril foi comparada através da medição de contaminação, escurecimento e indução após 28 dias de cultivo em MS Media ( Figura 1a). O crescimento do calo foi registrado aos 20, 37, 62 e 90 dias de cultura (Figura 1b). O calo derivado das folhas cultivadas in vitro mostrou um crescime.......
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Discussão
Este artigo apresenta o processo detalhado de estabelecimento de um modelo de metabolismo de pesticidas no tecido vegetal do chá, incluindo a seleção de explantes, a determinação da viabilidade celular, e o estabelecimento de uma cultura de suspensão de células de chá com alta metabólica Atividade. Todas as partes de um tecido vegetal podiam ser usadas para iniciar o calo em um ambiente esterilizado25. As folhas de chá foram escolhidas para a iniciação do calo neste estudo, não somente porque as f.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo programa nacional de pesquisa & desenvolvimento (2016YFD0200900) da China, a Fundação Nacional de ciência natural da China (n º 31772076 e n º 31270728), China pós-doutorado Science Foundation (2018M630700), e fundo aberto de Laboratório chave do estado da biologia e da utilização da planta do chá (SKLTOF20180111).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Acetamipride (99,8%) | Dr. Ehrenstorfer | 46717 | Nº CAS: 135410-20-7 |
| Acetonitrila (CAN, 99,9%) | Tedia | AS1122-801 | Nº CAS: 75-05-8 |
| Agar | Solarbio Science & Tecnologia | A8190 | Nº CAS: 9002-18-0 |
| Clotianidina (99,8%) | Dr. Ehrenstorfer | 525 | Nº CAS: 210880-92-5 |
| Dimetoato (98,5%) | Dr. Ehrenstorfer | 109217 | Nº CAS: 60-51-5 |
| Imidaclopride (99,8%) | Dr. Ehrenstorfer | 91029 | Nº CAS: 138261-41-3 |
| Imidaclothiz (99,5%) | Toronto Research Chemical | I275000 | Nº CAS: 105843-36-5 |
| Kinetin (KT, >98.0%) | Solarbio Ciência & Tecnologia | K8010 | Nº CAS: 525-79-1 |
| Ometoato (98,5%) | Dr. Ehrenstorfer | 105491 | Nº CAS: 1113-02-6 |
| Polivinilpolipirrolidona (PVPP) | Solarbio Science & Tecnologia | P8070 | Nº CAS: 25249-54-1 |
| Sacarose | Tocris Bioscience | 5511 | Nº CAS: 57-50-1 |
| Tiametoxam (99,8%) | Dr. Ehrenstorfer | 20625 | Nº CAS: 153719-23-4 |
| Cloreto de trifeniltetrazólio (TTC, 98,0%) | Solarbio Science & Tecnologia | T8170 | Nº CAS: 298-96-4 |
| Ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D, >98,0%) | Guangzhou Saiguo Biotech | D8100 | Nº CAS: 94-75-7 |
| coluna quiral | Agilent CYCLOSIL-B | 112-6632 | Coluna de cromatografia (30 m &vezes; 0,25 mm &vezes; 0,25 μ m) |
| Cromatografia gasosa (GC) | Shimadu | 2010-Plus | emparelhado com detector fotométrico de chama (FPD) |
| Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) | Agilent | 1260 | Emparelhado com detector ultravioleta (UV) |
| Coluna HSS T3 C18 | Coluna | de | cromatografia Waters 186003539 (100 mm &vezes; 2,1 mm &vezes; 1,8 μ m) |
| Cromatografia líquida de ultra-alta eficiência (UPLC) | Espectrômetro de massa de tempo de voo quadrupolo tandem | Agilent | 1290-6545 |
| Cromatografia líquida de ultra-alta eficiência (UPLC) | Thermo Scientific | Ultimate 3000-Q Exactive Focus | conectado a um espectrômetro de massa Orbitrap |
Referências
- Zhao, Y., et al. Tentative identification, quantitation, and principal component analysis of green pu-erh, green, and white teas using UPLC/DAD/MS. Food Chemistry. 126 (3), 1269-1277 (2011).
- Alcazar, A., et al.
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Reimpressões e permissões
