이 연구는 살충제 와 같은 전체 식물에 의해 채택될 수 있는 외부 화합물의 대사를 연구하는데 사용될 수 있는 차(동백나무)에서 유래된 세포 현탁액 배양을 확립하기 위한 프로토콜을 제시한다.
차 공장의 체외 조직을 사용하여 살충제 대사를 연구하기위한 플랫폼이 개발되었습니다. 멸균차 식물로부터의 잎은 식물 호르몬 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-D, 1.0 mg L-1)과 키네틴(KT, 0.1mg L-1)을 가진 무라시게및 스쿠그(MS) 기저 매에 느슨한 굳은살을 형성하도록 유도하였다. 캘러스는 각각 28 일 동안 지속되는 3 또는 4 라운드의 후 형성되었습니다. 느슨한 캘러스(약 3 g)를 동일한 식물 호르몬을 함유하는 B5 액상 배지로 접종한 후 25±1°C에서 어둠 속에서 흔들리는 인큐베이터(120 rpm)에서 배양하였다. 3-4 서브컬쳐 후, 차잎에서 유래된 세포 현탁액을 1:1 및 1:2(현탁액 어머니 액체: 신선한 배지) 사이의 하위 배양 비율로 확립하였다. 이 플랫폼을 사용하여, 6개의 살충제(5 μg mL-1 각 티아메톡삼, 이미다클로프리드, 아세트타미프리드, 이미다클로시즈, 디메토에이트 및 오메토아테)를 차 잎 유래 세포 현탁액 배양에 첨가하였다. 살충제의 대사를 액체 크로마토그래피 및 가스 크로마토그래피를 사용하여 추적했습니다. 차 세포 현탁액 배양의 유용성을 검증하기 위해, 처리된 세포 배양 및 손상되지 않은 식물에 존재하는 티아메톡산 및 디메토이트의 대사산물을 질량분광법을 사용하여 비교하였다. 처리된 차 세포 배양에서, 티아메톡산의 7개의 대사산물 및 디메토아테의 2개의 대사산물이 발견되었으며, 처리된 그대로 식물에서는 티아메톡삼의 대사산물 2개와 디메토에이트 중 하나만 발견되었다. 세포 현탁액의 사용은 특히 차와 같은 어려운 매트릭스에 대해 그대로 차 식물의 사용에 비해 대사 분석을 단순화했다.
차는 세계에서 가장 널리 소비되는 무알코올 음료중 하나입니다 1,2. 차는 우디다년 동백꽃의 잎과 싹에서 생산되며 L. 차 식물은 광대한 농장에서 재배되며 수많은 곤충 해충3,4에취약하다. 유기인산및네오니코티노이드 살충제는 백색파리, 잎호퍼 및 일부 레피도프테란 종6,7과 같은 해충으로부터 차 식물을 보호하기 위해 전신 살충제5로 자주 사용된다. 적용 후, 이러한 살충제는 흡수되거나 식물로 전이됩니다. 식물 내에서, 이러한 전신 살충제는 식물 효소에 의해 가수 분해, 산화 또는 환원 반응을 통해 형질전환될 수 있다. 이러한 변형 제품은 모 화합물보다 더 극성 및 덜 독성이 있을 수 있습니다. 그러나 일부 유기 인산염의 경우 일부 제품의 생체 활동이 더 높습니다. 예를 들어, 아세트산은 보다 독성이 강한 메타미도포스8, 9, 및 이메토에이트 내로 대사되어10,11. 식물 대사 연구는 따라서 식물 내의 농약의 운명을 결정하는 데 중요하다12.
식물 조직 배양은 농약 대사를 조사하기 위한 유용한 플랫폼으로 입증되었으며, 확인된 대사산물은 그대로식물13,14,15에서발견되는 것과 유사하다. 조직 배양, 특히 세포 현탁액 배양의 사용은 몇 가지 장점을 갖는다. 첫째, 실험은 미생물이 없는 실험을 수행하여 미생물에 의한 농약 변형 또는 분해의 간섭을 피할 수 있습니다. 둘째, 조직 배양은 언제든지 사용하기 위한 일관된 물질을 제공한다. 셋째, 대사 산물은 손상되지 않은 식물보다 조직 배양에서 추출하기가 더 쉬울 수 있으며, 조직 배양은 종종 인터링 화합물이 적고 화합물의 복잡성이 낮습니다. 마지막으로, 조직 배양은 단일 실험16에서일련의 농약 대사를 비교하는데 보다 용이하게 사용될 수 있다.
본 연구에서는 멸균 재배 차 식물의 잎에서 파생 된 세포 현탁액이 성공적으로 확립되었습니다. 차 세포 현탁액 배양은 6개의 전신 살충제의 발산 거동을 비교하기 위해 사용되었다.
이 상세한 프로토콜은 연구원이 차에 있는 xenobiotics의 신진 대사 운명을 공부하기 위하여 유용한 식물 조직 문화 플랫폼을 설치할 수 있도록 몇몇 지도를 제공하기 위한 것입니다.
이 기사는 이식물의 선택, 세포 생존력의 결정, 높은 대사를 가진 차 세포 현탁액 배양의 확립을 포함하여 차 식물 조직에 있는 농약 물질 대사의 모형을 설치하는 상세한 과정을 제시합니다 활동. 식물 조직의 모든 부분은 살균 된 환경에서 굳은 살을 시작하는 데 사용할 수있습니다 25. 차 잎은 이 연구에서 캘러스 개시를 위해 선택되었으며, 잎이 지하 부분보다 덜 오염되는 경?…
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 중국의 국가 핵심 연구 및 개발 프로그램 (2016YFD0200900), 중국의 국가 자연 과학 재단 (No. 31772076 및 No. 31270728), 중국 박사 후 과학 재단 (2018M630700), 그리고 오픈 펀드의 지원을 받았습니다. 차 식물 생물학 및 활용의 국가 키 연구소 (SKLTOF20180111).
Acetamiprid (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 46717 | CAS No: 135410-20-7 |
Acetonitrile (CAN, 99.9%) | Tedia | AS1122-801 | CAS No: 75-05-8 |
Agar | Solarbio Science & Technology | A8190 | CAS No: 9002-18-0 |
Clothianidin (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 525 | CAS No: 210880-92-5 |
Dimethoate (98.5%) | Dr. Ehrenstorfer | 109217 | CAS No: 60-51-5 |
Imidacloprid (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 91029 | CAS No: 138261-41-3 |
Imidaclothiz (99.5%) | Toronto Research Chemical | I275000 | CAS No: 105843-36-5 |
Kinetin (KT, >98.0%) | Solarbio Science & Technology | K8010 | CAS No: 525-79-1 |
Omethoate (98.5%) | Dr. Ehrenstorfer | 105491 | CAS No: 1113-02-6 |
Polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) | Solarbio Science & Technology | P8070 | CAS No: 25249-54-1 |
Sucrose | Tocris Bioscience | 5511 | CAS No: 57-50-1 |
Thiamethoxam (99.8%) | Dr. Ehrenstorfer | 20625 | CAS No: 153719-23-4 |
Triphenyltetrazolium Chloride (TTC, 98.0%) | Solarbio Science & Technology | T8170 | CAS No: 298-96-4 |
2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D, >98.0%) | Guangzhou Saiguo Biotech | D8100 | CAS No: 94-75-7 |
chiral column | Agilent CYCLOSIL-B | 112-6632 | Chromatography column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) |
Gas chromatography (GC) | Shimadu | 2010-Plus | Paired with Flame Photometric Detector (FPD) |
High-performance liquid chromatography (HPLC) | Agilent | 1260 | Paired with Ultraviolet detector (UV) |
HSS T3 C18 column | Waters | 186003539 | Chromatography column (100 mm × 2.1 mm × 1.8 μm) |
Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) | Agilent | 1290-6545 | Tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometer (QTOF) |
Ultra-high-performance liquid chromatography (UPLC) | Thermo Scientific | Ultimate 3000-Q Exactive Focus | Connected to a Orbitrap mass spectrometer |