Visualisering van lymfeklieren structuur en cellulaire lokalisatie met behulp van ex-vivo confocale microscopie
Summary
Dit protocol beschrijft een techniek om verschillende celpopulaties in aftappen van lymfeklieren zonder veranderingen in de orgaan structuur te beeld.
Abstract
Lymfeklieren (LNs) zijn organen verspreid in het lichaam, waar de aangeboren immuunresponsen verbinding kunnen maken met de adaptieve immuniteit. In feite zijn LNs strategisch geïnterposeerd in het pad van de lymfevaten, waardoor intiem contact van weefsel antigenen met alle ingezeten immuuncellen in de LN mogelijk is. Dus, het begrijpen van de cellulaire samenstelling, distributie, locatie en interactie met behulp van ex vivo hele LN Imaging zal toevoegen aan de kennis over hoe het lichaam coördineert lokale en systemische immuunresponsen. Dit protocol toont een ex-vivo-beeldvormings strategie na een in vivo-toediening van fluorescerende-gelabelde antilichamen die een zeer reproduceerbare en eenvoudig uit te voeren methodologie mogelijk maakt door gebruik te maken van conventionele confocale microscopen en voorraad reagentia. Door subcutane injectie van antilichamen is het mogelijk om verschillende celpopulaties te labelen in drainage LNs zonder de weefselstructuren te beïnvloeden die potentieel kunnen worden aangetast door een conventionele immunofluorescentie microscopie-techniek.
Introduction
Lymfeklieren (LNs) zijn Ovoid-vormige organen wijd aanwezig in het lichaam met de cruciale functie van het overbruggen van de aangeboren en adaptieve immuunresponsen. LNs filteren de lymfe om vreemde deeltjes en kankercellen te identificeren om een immuunrespons tegen hen te monteren1. Antigeen cellen (Apc’s), T-cellen en B-cellen werken samen om antigeen-specifieke antilichamen (Humorale immuniteit) en cytotoxische lymfocyten (cellulaire immuniteit) te genereren om de vreemde deeltjes en kankercellen2te elimineren. Zo zal het begrijpen van de dynamiek van de immuuncellen die aanwezig zijn in het lymfestelsel belangrijke gevolgen hebben voor de vaccin ontwikkeling en kanker immunotherapie.
De opkomst van krachtige microscopen-inclusief nieuwe confocale en superresolutie microscopen-heeft een buitengewone vooruitgang toegestaan in het begrijpen van hoe verschillende immuuncelpopulaties zich gedragen in hun eigen omgeving3. Het is nu mogelijk om verschillende gelijktijdige celsubtypen te maken met behulp van een combinatie van sondes met genetisch gemodificeerde muizen die fluorescerende eiwitten onder controle van specifieke doelstellingen4,5uitdrukken. In feite zijn hoge dimensionale technieken, waaronder massa cytometrie en multi-parametrische stromings analyse, van cruciaal belang geweest om onze kennis uit te breiden over verschillende compartimentalisatie en functionaliteit van de immuuncel in de gezondheid en ziekte6, 7. om monsters voor deze technieken voor te bereiden, hebben weefsels echter spijsvertering nodig en worden cellen gescheiden van hun natuurlijke milieu om te worden geanalyseerd in celsuspensies. Om deze beperkingen te overtreffen en een betere vertaling in de biologie mogelijk te maken, is het doel van het hier voorgestelde protocol om een eenvoudige methodologie toe te passen op beeld ex vivo hele lymfeklieren met behulp van voorraden confocale microscopen met het voordeel van verbeterde snelheid, weefsel behoud van de structuur en de levensvatbaarheid van de cellen in vergelijking met de conventionele immunofluorescentie kleuring. Door deze aanpak te gebruiken, konden we aantonen dat muizen deficiënte voor γδ T-cellen, een subtype van T-lymfocyten dat betrokken is bij vroege verdediging van de gastheer tegen pathogenen4, follikels en T-celzones hebben aangetast in vergelijking met wild type muizen. Deze bevindingen lieten ons toe om een studie uit te voeren waarin we hebben aangetoond dat de γδ T-cellen een cruciale rol spelen in de homeostase van lymfoïde organen en humorale immuunrespons4. Bovendien biedt dit protocol een fysiologisch traject voor sondes en antilichamen om de lymfeklier te bereiken, omdat ze subcutaan worden toegediend en afgevoerd door de weefsel lymfatische circulatie, voortbouwend op eerdere rapporten die in situ labeling werden gebruikt met antilichamen om lymfatische structuren te visualiseren8,9, Germinal CenterDynamics 10,11,12, en doelen gemakkelijk toegankelijk voor de bloedstroom13 ,14,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
De combinatie van beeldvorming met andere technieken, waaronder moleculaire biologie en hoog-dimensionale immunophenotypering heeft ons vermogen om immuuncellen in hun inheemse context te onderzoeken, verbeterd. In feite, terwijl andere benaderingen weefsel spijsvertering en celisolatie kunnen vereisen-wat kan leiden tot verlies van weefsel integriteit-het gebruik van in vivo of ex vivo beeldvorming geeft een groot voordeel bij het onderzoeken van verschillende subtypen van cellen in een geografische mode<sup class="xref…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de NIH (R01 AI43458 naar H.L.W.).
Materials
| BV421 anti-CD4 | BD Horizon | 562891 | GK1.5; 0.2 mg mL-1 |
| BB515 anti-CD19 | BD Horizon | 564509 | 1D3; 0.2 mg mL-1 |
| BB515 Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Horizon | 564418 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
| BV421 Mouse IgG2b, K Isotype Control | BD Horizon | 562603 | R35-38 0.2 mg mL-1 |
| Cellview culture dish | Greiner-Bio | 627861 | 35×10 mm with glass bottom |
| Insulin syringes | BD Plastipak | – | Insulin U-100 |
| Kimwipes | Kimtech Science Brand | 7557 | size 21 x 20 cm / 100 sheets per box |
| Microsurgery curved forceps | WEP Surgical Instruments | custom made | 12.5 cm |
| Microsurgery curved scissors | WEP Surgical Instruments | custom made | 11.5 cm |
| Needle | BD PrecisionGlide | – | 30 gauge × ½ inch |
| Nikon Eclipse Te + A1R confocal head | Nikon | – | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
| PE anti-F4/80 | BD Pharmigen | 565410 | T45-2342; 0.2 mg mL-1 |
| PE Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Pharmigen | 553930 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
| Zeiss LSM 710 confocal microscope | Zeiss | – | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
Referências
- Willard-Mack, C. L. Normal structure, function, and histology of lymph nodes. Toxicologic Pathology. 34, 409-424 (2006).
- Tas, J. M., et al. Visualizing antibody affinity maturation in germinal centers. Science. 351, 1048-1054 (2016).
- David, B. A., et al. Combination of Mass Cytometry and Imaging Analysis Reveals Origin, Location, and Functional Repopulation of Liver Myeloid Cells in Mice. Gastroenterology. 151, 1176-1191 (2016).
- Rezende, R. M., et al. gammadelta T cells control humoral immune response by inducing T follicular helper cell differentiation. Nature Communications. 9, 3151 (2018).
- Nakagaki, B. N., et al. Generation of a triple-fluorescent mouse strain allows a dynamic and spatial visualization of different liver phagocytes in vivo. Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 91 (suppl 1), e20170317 (2019).
- Ajami, B., et al. Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models. Nature Neuroscience. 21, 541-551 (2018).
- Becher, B., et al. High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system. Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).
- McElroy, M., et al. Fluorescent LYVE-1 antibody to image dynamically lymphatic trafficking of cancer cells in vivo. Journal of Surgical Research. 151, 68-73 (2009).
- Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity. The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).
- Hauser, A. E., et al. Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns. Immunity. 26, 655-667 (2007).
- Allen, C. D., Okada, T., Tang, H. L., Cyster, J. G. Imaging of germinal center selection events during affinity maturation. Science. 315, 528-531 (2007).
- Arnon, T. I., Horton, R. M., Grigorova, I. L., Cyster, J. G. Visualization of splenic marginal zone B-cell shuttling and follicular B-cell egress. Nature. 493, 684-688 (2013).
- Sipkins, D. A., et al. In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment. Nature. 435, 969-973 (2005).
- Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W., Cyster, J. G. Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport. Nature Immunology. 9, 54-62 (2008).
- Pereira, J. P., An, J., Xu, Y., Huang, Y., Cyster, J. G. Cannabinoid receptor 2 mediates the retention of immature B cells in bone marrow sinusoids. Nature Immunology. 10, 403-411 (2009).
- Nakagaki, B. N., et al. Immune and metabolic shifts during neonatal development reprogram liver identity and function. Journal of Hepatology. (6), 1294-1307 (2018).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
- Roozendaal, R., et al. Conduits mediate transport of low-molecular-weight antigen to lymph node follicles. Immunity. 30, 264-276 (2009).
- Sarder, P., et al. All-near-infrared multiphoton microscopy interrogates intact tissues at deeper imaging depths than conventional single- and two-photon near-infrared excitation microscopes. Journal of Biomedical Optics. 18, 106012 (2013).
