تصور بنية العقدة الليمفاوية وتوطين الخلايا باستخدام الفحص المجهري السابق فيفيفو
Summary
يصف هذا البروتوكول تقنية لتصوير مجموعات الخلايا المختلفة في استنزاف الغدد الليمفاوية دون تعديلات في بنية الجهاز.
Abstract
العقد الليمفاوية (LNs) هي أجهزة منتشرة داخل الجسم، حيث يمكن للاستجابات المناعية الفطرية الاتصال مع المناعة التكيفية. في الواقع، يتم تداخل النفثالينات بشكل استراتيجي في مسار الأوعية اللمفاوية، مما يسمح بالاتصال الحميم لمستضدات الأنسجة مع جميع الخلايا المناعية المقيمة في LN. وهكذا, فهم التكوين الخلوي, توزيع, الموقع والتفاعل باستخدام خارج الجسم الحي كله LN التصوير سوف تضيف إلى المعرفة حول كيفية تنسيق الجسم الاستجابات المناعية المحلية والنظامية. يُظهر هذا البروتوكول استراتيجية تصوير في الجسم الحي بعد إدارة في الجسم الحي للأجسام المضادة التي تحمل علامة الفلورسنت وتسمح بمنهجية قابلة للاستنساخ وسهلة الأداء باستخدام المجاهر البؤرية التقليدية وكواشف الأسهم. من خلال الحقن تحت الجلد من الأجسام المضادة، فمن الممكن تسمية مجموعات الخلايا المختلفة في استنزاف النفثالينات دون التأثير على هياكل الأنسجة التي يمكن أن تتضرر من قبل تقنية الفحص المجهري المناعي التقليدية.
Introduction
العقد الليمفاوية (LNs) هي أجهزة على شكل فراغ موجودة على نطاق واسع في جميع أنحاء الجسم مع وظيفة حاسمة من سد الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية. LNs تصفية الليمفاوية من أجل تحديد الجسيمات الأجنبية والخلايا السرطانية لتركيب استجابة مناعية ضدهم1. مستضد تقديم الخلايا (APCs), الخلايا T والخلايا B تعمل جنبا إلى جنب لتوليد الأجسام المضادة الخاصة بالمستضد (الحصانة الفكاهية) والخلايا الليمفاوية السامة للخلايا (الحصانة الخلوية) للقضاء على الجسيمات الأجنبية والخلايا السرطانية2. وبالتالي، فإن فهم ديناميات الخلايا المناعية الموجودة في الجهاز اللمفاوي سيكون له آثار هامة على تطوير اللقاح والعلاج المناعي للسرطان.
وقد سمح ظهور المجاهر القوية – بما في ذلك المجاهر الجديدة ذات البؤرة وفائقة الدقة – بتقدم غير عادي في فهم كيفية عمل مختلف مجموعات الخلايا المناعية في بيئتها الأصلية3. فمن الممكن الآن لتصوير العديد من الأنواع الفرعية الخلية في وقت واحد باستخدام مزيج من تحقيقات مع الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتينات الفلورية تحت السيطرة على أهداف محددة4،5. في الواقع، كانت التقنيات عالية الأبعاد، بما في ذلك قياس الخلايا الشامل وتحليل التدفق متعدد البارامترية حاسمة لتوسيع معرفتنا حول تجزئة الخلايا المناعية المختلفة والوظائف في الصحة والمرض6، 7.ومع ذلك، لإعداد عينات لهذه التقنيات، والأنسجة تحتاج إلى الهضم ويتم فصل الخلايا من محيطها الطبيعي لتحليلها في تعليق الخلايا. لتجاوز هذه القيود والسماح بترجمة أفضل في علم الأحياء، والهدف من البروتوكول المقترح هنا هو تطبيق منهجية واضحة لصورة العقد الليمفاوية في الجسم الحي كله باستخدام المجاهر البؤر ية الأسهم مع الاستفادة من تحسين السرعة والأنسجة الحفاظ على هيكل، وجدوى الخلية بالمقارنة مع تلطيخ المناعية التقليدية. باستخدام هذا النهج، كنا قادرين على إظهار أن الفئران ناقصة لخلايا T γδ، وهونوع فرعي من الخلايا الليمفاوية T المشاركة في الدفاع المبكر المضيف ضد مسببات الأمراض 4، قد عرضت للخطر بصيلات ومناطق الخلايا T بالمقارنة مع الفئران من النوع البري. هذه النتائج سمحت لنا لمتابعة دراسة التي أظهرنا أن الخلايا T γδ تلعب دورا حاسما في التوازن من الأجهزة اللمفاوية والاستجابة المناعية الفكاهية4. وعلاوة على ذلك، يوفر هذا البروتوكول مساراً فيزيولوجيا للتحقيقات والأجسام المضادة للوصول إلى العقدة الليمفاوية، حيث أنها تدار تحت الجلد وتتبدد من خلال الدورة الدموية اللمفاوية للأنسجة، استناداً إلى التقارير السابقة التي استخدمت في وضع العلامات في الموقع مع الأجسام المضادة لتصور الهياكل المرتبطة اللمفاوية8،9، ديناميات مركز الإنبات10،11،12، وأهداف يمكن الوصول إليها بسهولة لتدفق الدم13 ،14،15.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد عزز الجمع بين التصوير مع تقنيات أخرى، بما في ذلك البيولوجيا الجزيئية والنماذج المناعية عالية الأبعاد قدرتنا على التحقيق في الخلايا المناعية في سياقها الأصلي. في الواقع، في حين أن النهج الأخرى قد تتطلب هضم الأنسجة وعزل الخلايا – والتي يمكن أن تؤدي إلى فقدان سلامة الأنسجة – استخدام التص?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R01 AI43458 إلى H.L.W.).
Materials
| BV421 anti-CD4 | BD Horizon | 562891 | GK1.5; 0.2 mg mL-1 |
| BB515 anti-CD19 | BD Horizon | 564509 | 1D3; 0.2 mg mL-1 |
| BB515 Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Horizon | 564418 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
| BV421 Mouse IgG2b, K Isotype Control | BD Horizon | 562603 | R35-38 0.2 mg mL-1 |
| Cellview culture dish | Greiner-Bio | 627861 | 35×10 mm with glass bottom |
| Insulin syringes | BD Plastipak | – | Insulin U-100 |
| Kimwipes | Kimtech Science Brand | 7557 | size 21 x 20 cm / 100 sheets per box |
| Microsurgery curved forceps | WEP Surgical Instruments | custom made | 12.5 cm |
| Microsurgery curved scissors | WEP Surgical Instruments | custom made | 11.5 cm |
| Needle | BD PrecisionGlide | – | 30 gauge × ½ inch |
| Nikon Eclipse Te + A1R confocal head | Nikon | – | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
| PE anti-F4/80 | BD Pharmigen | 565410 | T45-2342; 0.2 mg mL-1 |
| PE Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Pharmigen | 553930 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
| Zeiss LSM 710 confocal microscope | Zeiss | – | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
Referências
- Willard-Mack, C. L. Normal structure, function, and histology of lymph nodes. Toxicologic Pathology. 34, 409-424 (2006).
- Tas, J. M., et al. Visualizing antibody affinity maturation in germinal centers. Science. 351, 1048-1054 (2016).
- David, B. A., et al. Combination of Mass Cytometry and Imaging Analysis Reveals Origin, Location, and Functional Repopulation of Liver Myeloid Cells in Mice. Gastroenterology. 151, 1176-1191 (2016).
- Rezende, R. M., et al. gammadelta T cells control humoral immune response by inducing T follicular helper cell differentiation. Nature Communications. 9, 3151 (2018).
- Nakagaki, B. N., et al. Generation of a triple-fluorescent mouse strain allows a dynamic and spatial visualization of different liver phagocytes in vivo. Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 91 (suppl 1), e20170317 (2019).
- Ajami, B., et al. Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models. Nature Neuroscience. 21, 541-551 (2018).
- Becher, B., et al. High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system. Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).
- McElroy, M., et al. Fluorescent LYVE-1 antibody to image dynamically lymphatic trafficking of cancer cells in vivo. Journal of Surgical Research. 151, 68-73 (2009).
- Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity. The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).
- Hauser, A. E., et al. Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns. Immunity. 26, 655-667 (2007).
- Allen, C. D., Okada, T., Tang, H. L., Cyster, J. G. Imaging of germinal center selection events during affinity maturation. Science. 315, 528-531 (2007).
- Arnon, T. I., Horton, R. M., Grigorova, I. L., Cyster, J. G. Visualization of splenic marginal zone B-cell shuttling and follicular B-cell egress. Nature. 493, 684-688 (2013).
- Sipkins, D. A., et al. In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment. Nature. 435, 969-973 (2005).
- Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W., Cyster, J. G. Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport. Nature Immunology. 9, 54-62 (2008).
- Pereira, J. P., An, J., Xu, Y., Huang, Y., Cyster, J. G. Cannabinoid receptor 2 mediates the retention of immature B cells in bone marrow sinusoids. Nature Immunology. 10, 403-411 (2009).
- Nakagaki, B. N., et al. Immune and metabolic shifts during neonatal development reprogram liver identity and function. Journal of Hepatology. (6), 1294-1307 (2018).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
- Roozendaal, R., et al. Conduits mediate transport of low-molecular-weight antigen to lymph node follicles. Immunity. 30, 264-276 (2009).
- Sarder, P., et al. All-near-infrared multiphoton microscopy interrogates intact tissues at deeper imaging depths than conventional single- and two-photon near-infrared excitation microscopes. Journal of Biomedical Optics. 18, 106012 (2013).
