Visualisation de la structure des ganglions lymphatiques et de la localisation cellulaire à l'aide de la microscopie confocale ex-Vivo
Summary
Ce protocole décrit une technique pour imager différentes populations de cellules dans les ganglions lymphatiques drainants sans altérations dans la structure d’organe.
Abstract
Les ganglions lymphatiques (LN) sont des organes répartis dans le corps, où les réponses immunitaires innées peuvent se connecter à l’immunité adaptative. En fait, les LN sont stratégiquement interposés dans le chemin des vaisseaux lymphatiques, permettant le contact intime des antigènes de tissu avec toutes les cellules immunitaires résidentes dans le LN. Ainsi, la compréhension de la composition cellulaire, de la distribution, de l’emplacement et de l’interaction à l’aide de l’imagerie LN complète ex vivo permettra d’ajouter à la connaissance sur la façon dont le corps coordonne les réponses immunitaires locales et systémiques. Ce protocole montre une stratégie d’imagerie ex vivo à la suite d’une administration in vivo d’anticorps fluorescents qui permet une méthodologie très reproductible et facile à réaliser en utilisant des microscopes confocals conventionnels et des réactifs. Grâce à l’injection sous-cutanée d’anticorps, il est possible d’étiqueter différentes populations cellulaires dans le drainage des LN sans affecter les structures tissulaires qui peuvent être potentiellement endommagées par une technique conventionnelle de microscopie d’immunofluorescence.
Introduction
Les ganglions lymphatiques (LN) sont des organes en forme d’ovoïde largement présents dans tout le corps avec la fonction cruciale de combler les réponses immunitaires innées et adaptatives. Les LN filtrent la lymphe afin d’identifier les particules étrangères et les cellules cancéreuses pour monter une réponse immunitaire contre eux1. Les cellules de présentation d’antigènes (APC), les lymphocytes T et les cellules B travaillent aux côtés pour générer des anticorps spécifiques à l’antigène (immunité humoristique) et des lymphocytes cytotoxiques (immunité cellulaire) pour éliminer les particules étrangères et les cellules cancéreuses2. Ainsi, la compréhension de la dynamique des cellules immunitaires présentes dans le système lymphatique aura des implications importantes pour le développement du vaccin et l’immunothérapie contre le cancer.
L’avènement de microscopes puissants – y compris de nouveaux microscopes confocal et super résolution – a permis un progrès extraordinaire dans la compréhension de la façon dont les différentes populations de cellules immunitaires se comportent dans leur environnement indigène3. Il est maintenant possible d’imager plusieurs sous-types cellulaires simultanés à l’aide d’une combinaison de sondes avec des souris génétiquement modifiées qui expriment des protéines fluorescentes sous contrôle de cibles spécifiques4,5. En fait, les techniques de haute dimension, y compris la cytométrie de masse et l’analyse multi-paramétrique de flux ont été cruciales pour élargir nos connaissances sur la compartimentation et la fonctionnalité de cellules immunitaires différentes dans la santé et la maladie6, 7. Cependant, pour préparer des échantillons pour ces techniques, les tissus ont besoin de digestion et les cellules sont séparées de leur milieu naturel pour être analysées dans des suspensions cellulaires. Pour dépasser ces limitations et permettre une meilleure traduction en biologie, l’objectif du protocole proposé ici est d’appliquer une méthodologie simple pour l’image ex vivo ganglions lymphatiques entiers en utilisant des microscopes confocal stock avec l’avantage d’une vitesse améliorée, tissu la préservation de la structure et la viabilité cellulaire par rapport à la coloration immunofluorescence conventionnelle. En utilisant cette approche, nous avons pu montrer que les souris déficientes pour les lymphocytes T, un sous-type de lymphocyte T impliqué dans la défense précoce de l’hôte contre les agents pathogènes4, ont compromis les follicules et les zones de cellules T par rapport aux souris de type sauvage. Ces résultats nous ont permis de poursuivre une étude dans laquelle nous avons démontré que les lymphocytes T jouent un rôle critique dans l’homéostasie des organes lymphoïdes et la réponse immunitaire humoristique4. En outre, ce protocole fournit une voie physiologique pour que les sondes et les anticorps atteignent le ganglion lymphatique, car ils sont administrés sous-cutanée et se dissipent par la circulation lymphatique de tissu, s’appuyant sur les rapports précédents qui ont employé l’étiquetage in situ avec des anticorps pour visualiser les structures lymphatiques-associées8,9, dynamique germinale centre10,11,12, et les cibles facilement accessibles à la circulation sanguine13 ,14,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
La combinaison de l’imagerie avec d’autres techniques, y compris la biologie moléculaire et l’immunophénotypage de haute dimension a amélioré notre capacité d’étudier les cellules immunitaires dans leur contexte natif. En fait, alors que d’autres approches peuvent nécessiter la digestion des tissus et l’isolement cellulaire – ce qui peut conduire à la perte de l’intégrité des tissus – l’utilisation de l’imagerie in vivo ou ex vivo accorde un grand avantage dans l’étude de différents sous-types cellulaires d’u…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les NIH (R01 AI43458 à H.L.W.).
Materials
| BV421 anti-CD4 | BD Horizon | 562891 | GK1.5; 0.2 mg mL-1 |
| BB515 anti-CD19 | BD Horizon | 564509 | 1D3; 0.2 mg mL-1 |
| BB515 Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Horizon | 564418 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
| BV421 Mouse IgG2b, K Isotype Control | BD Horizon | 562603 | R35-38 0.2 mg mL-1 |
| Cellview culture dish | Greiner-Bio | 627861 | 35×10 mm with glass bottom |
| Insulin syringes | BD Plastipak | – | Insulin U-100 |
| Kimwipes | Kimtech Science Brand | 7557 | size 21 x 20 cm / 100 sheets per box |
| Microsurgery curved forceps | WEP Surgical Instruments | custom made | 12.5 cm |
| Microsurgery curved scissors | WEP Surgical Instruments | custom made | 11.5 cm |
| Needle | BD PrecisionGlide | – | 30 gauge × ½ inch |
| Nikon Eclipse Te + A1R confocal head | Nikon | – | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
| PE anti-F4/80 | BD Pharmigen | 565410 | T45-2342; 0.2 mg mL-1 |
| PE Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Pharmigen | 553930 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
| Zeiss LSM 710 confocal microscope | Zeiss | – | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
Referências
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