Visualisierung der Lymphknotenstruktur und Zelllokalisierung mittels Ex-Vivo Konfokalmikroskopie
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Technik, um verschiedene Zellpopulationen in entwässernden Lymphknoten ohne Veränderungen in der Organstruktur abzubilden.
Abstract
Lymphknoten (LNs) sind Organe, die sich im Körper ausbreiten, wo sich die angeborenen Immunantworten mit der adaptiven Immunität verbinden können. Tatsächlich sind LNs strategisch im Pfad der Lymphgefäße intergesetzt, was einen intimen Kontakt von Gewebeantigenen mit allen ansässigen Immunzellen in der LN ermöglicht. So wird das Verständnis der zellulären Zusammensetzung, Verteilung, Lage und Interaktion mit ex vivo ganze LN-Bildgebung das Wissen darüber, wie der Körper lokale und systemische Immunantworten koordiniert, ergänzen. Dieses Protokoll zeigt eine ex vivo-Bildgebungsstrategie nach einer In-vivo-Verabreichung von fluoreszierend markierten Antikörpern, die eine sehr reproduzierbare und leicht durchzuführende Methodik mit herkömmlichen konfokalen Mikroskopen und Stoffreagenzien ermöglicht. Durch subkutane Injektion von Antikörpern ist es möglich, verschiedene Zellpopulationen in entwässernden LNs zu kennzeichnen, ohne Gewebestrukturen zu beeinträchtigen, die durch eine herkömmliche Immunfluoreszenzmikroskopie-Technik potenziell beschädigt werden können.
Introduction
Lymphknoten (LNs) sind eiförmige Organe, die weit verbreitet im ganzen Körper vorhanden sind, mit der entscheidenden Funktion, die angeborenen und adaptiven Immunantworten zu überbrücken. LNs filtern die Lymphe, um Fremdpartikel und Krebszellen zu identifizieren, um eine Immunantwort gegen sie zu montieren1. Antigen-präsentierende Zellen (APCs), T-Zellen und B-Zellen arbeiten zusammen, um antigenspezifische Antikörper (humorale Immunität) und zytotoxische Lymphozyten (zelluläre Immunität) zu erzeugen, um die Fremdpartikel und Krebszellen zu beseitigen2. Das Verständnis der Dynamik der im Lymphsystem vorhandenen Immunzellen wird daher wichtige Auswirkungen auf die Impfstoffentwicklung und die Krebsimmuntherapie haben.
Das Aufkommen leistungsstarker Mikroskope – einschließlich neuer konfokaler und superhochauflösender Mikroskope – hat einen außergewöhnlichen Fortschritt im Verständnis des Verständnisses ermöglicht, wie sich verschiedene Immunzellpopulationen in ihrer heimischen Umgebung verhalten3. Es ist nun möglich, mehrere simultane Zellsubtypen mit einer Kombination von Sonden mit genetisch veränderten Mäusen abzubilden, die fluoreszierende Proteine unter Kontrolle spezifischer Targets4,5ausdrücken. In der Tat waren hochdimensionale Techniken, einschließlich Massenzytometrie und multiparametrische Strömungsanalyse, entscheidend für die Erweiterung unseres Wissens über verschiedene Immunzellabteilalisation und Funktionalität in Gesundheit und Krankheit6, 7. Um jedoch Proben für diese Techniken vorzubereiten, müssen Gewebe verdaut werden und Zellen werden von ihrem natürlichen Milieu getrennt, um in Zellsuspensionen analysiert zu werden. Um diese Grenzen zu übertreffen und eine bessere Übersetzung in die Biologie zu ermöglichen, ist das Ziel des hier vorgeschlagenen Protokolls, eine einfache Methodik anzuwenden, um ex vivo ganze Lymphknoten mit Stock-Konfokalmikroskopen mit dem Vorteil einer verbesserten Geschwindigkeit, Gewebe Strukturerhaltung und Zelllebensfähigkeit im Vergleich zur herkömmlichen Immunfluoreszenzfärbung. Mit diesem Ansatz konnten wir zeigen, dass Mäuse, die einen Mangel an T-Zellen haben, einem Subtyp von T-Lymphozyten, der an der frühen Abwehr von Krankheitserregern beteiligt ist4, Follikel und T-Zellzonen im Vergleich zu Wildtypmäusen kompromittiert haben. Diese Ergebnisse ermöglichten es uns, eine Studie zu verfolgen, in der wir zeigten, dass T-Zellen eine entscheidende Rolle bei der Homöostase von Lymphorganen und der humoralen Immunantwort spielen4. Darüber hinaus bietet dieses Protokoll einen physiologischen Weg für Sonden und Antikörper, um den Lymphknoten zu erreichen, da sie subkutan verabreicht werden und sich durch die Lymphzirkulation des Gewebes ableiten, aufbauend auf früheren Berichten, die in situ-Kennzeichnung verwendet wurden. mit Antikörpern zur Visualisierung lymphatischer Strukturen8,9, Keimzentrumsdynamik10,11,12und Targets leicht zugänglich für den Blutfluss13 ,14,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Kombination von Bildgebung mit anderen Techniken, einschließlich Molekularbiologie und hochdimensionaler Immunphenotypisierung, hat unsere Fähigkeit verbessert, Immunzellen in ihrem nativen Kontext zu untersuchen. Während andere Ansätze gewebeverdauliche und zellisolierte Anwendungen erfordern – was zu einem Verlust der Gewebeintegrität führen kann – bietet die Verwendung von In-vivo- oder Ex-vivo-Bildgebung einen großen Vorteil bei der geographischen Untersuchung verschiedener Zellsubtypen<sup class="xref…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom NIH (R01 AI43458 bis H.L.W.) unterstützt.
Materials
| BV421 anti-CD4 | BD Horizon | 562891 | GK1.5; 0.2 mg mL-1 |
| BB515 anti-CD19 | BD Horizon | 564509 | 1D3; 0.2 mg mL-1 |
| BB515 Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Horizon | 564418 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
| BV421 Mouse IgG2b, K Isotype Control | BD Horizon | 562603 | R35-38 0.2 mg mL-1 |
| Cellview culture dish | Greiner-Bio | 627861 | 35×10 mm with glass bottom |
| Insulin syringes | BD Plastipak | – | Insulin U-100 |
| Kimwipes | Kimtech Science Brand | 7557 | size 21 x 20 cm / 100 sheets per box |
| Microsurgery curved forceps | WEP Surgical Instruments | custom made | 12.5 cm |
| Microsurgery curved scissors | WEP Surgical Instruments | custom made | 11.5 cm |
| Needle | BD PrecisionGlide | – | 30 gauge × ½ inch |
| Nikon Eclipse Te + A1R confocal head | Nikon | – | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
| PE anti-F4/80 | BD Pharmigen | 565410 | T45-2342; 0.2 mg mL-1 |
| PE Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Pharmigen | 553930 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
| Zeiss LSM 710 confocal microscope | Zeiss | – | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
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