전 생체 내 공초점 현미경을 사용하여 림프절 구조 및 세포 국소화 시각화
Summary
이 프로토콜은 장기 구조의 변화없이 림프절을 배출하는 다른 세포 집단을 이미지화하는 기술을 설명합니다.
Abstract
림프절 (LN)은 타고난 면역 반응이 적응 면역과 연결할 수있는 신체 내에서 퍼지는 기관입니다. 사실, LN은 전략적으로 림프관의 경로에 개입되어 LN의 모든 상주 면역 세포와 조직 항원과 친밀한 접촉을 허용합니다. 따라서, 전 생체 내 LN 이미징을 사용하여 세포 조성, 분포, 위치 및 상호 작용을 이해하는 것은 신체가 국소 및 전신 면역 반응을 어떻게 조정시키는지에 대한 지식을 추가할 것이다. 이 프로토콜은 기존의 공초점 현미경 및 재고 시약을 사용하여 매우 재현 가능하고 수행하기 쉬운 방법론을 허용하는 형광 표지 항체의 생체 내 투여 에 따른 생체 내 이미징 전략을 보여줍니다. 항체의 피하 주입을 통해, 기존의 면역 형광 현미경 기술에 의해 잠재적으로 손상될 수 있는 조직 구조에 영향을 미치지 않고 배수 LN에 있는 다른 세포 인구를 표지하는 것이 가능합니다.
Introduction
림프절 (LN)은 선천적이고 적응성 면역 반응을 연결하는 중요한 기능을 가진 몸 전체에 널리 존재하는 난형 형 기관입니다. LN은 이물질과 암세포를 식별하기 위해 림프를 걸루어면역 반응을 장착한다 1. 항원 제시 세포(APC), T 세포 및 B 세포는 항원 특이적 항체(체액성 면역) 및 세포독성 림프구(cellular immunity)를생성하여 이물질 및 암세포를 제거하기 위해 함께 작용한다 2. 따라서, 림프계에 존재하는 면역 세포의 역학을 이해하는 것은 백신 개발 및 암 면역 요법에 중요한 영향을 미칠 것이다.
새로운 공초점 및 초고해상도 현미경을 포함한 강력한 현미경의 출현은 다른 면역 세포 집단이 그들의 모국환경에서어떻게 행동하는지 이해하는 특별한 발전을 허용했습니다 3. 이제 특정 표적4,5의통제하에 형광 단백질을 발현하는 유전자 변형 마우스와 프로브의 조합을 사용하여 여러 동시 세포 아류형을 영상화할 수 있다. 실제로, 질량 세포 분석 및 다중 파라메트릭 흐름 분석을 포함한 고차원 기술은 건강과 질병의 다양한 면역 세포 구획화 및 기능에 대한 지식을 확장하는 데 매우 중요했습니다6, 7. 그러나, 이러한 기술에 대한 샘플을 준비하기 위해, 조직은 소화가 필요하고 세포는 세포 현탁액에서 분석될 수 있도록 천연 밀리외에서 분리된다. 이러한 한계를 능가하고 생물학에서 더 나은 번역을 허용하기 위해, 여기에 제안 된 프로토콜의 목표는 개선 된 속도, 조직의 이점으로 스톡 공초점 현미경을 사용하여 생체 전체 림프절을 이미지화하는 간단한 방법론을 적용하는 것입니다. 기존의 면역형광 염색에 비해 구조 보존 및 세포 생존능력. 이 접근법을 사용하여, 우리는 γδ T 세포에 대한 결핍 마우스가 병원체에 대하여 호스트 초기 방어에 관여하는T 림프구의 특수형 4, 야생 형 마우스에 비해 여포 및 T 세포 영역을 손상했다는 것을 보여줄 수 있었습니다. 이 사실 인정은 우리가 γδ T 세포가 림프기관 및 체액 성 면역 반응의 항상성에 있는 중요한역할을 한다는 것을 설명한 연구 결과를 추구하는 것을 허용했습니다 4. 또한, 이 프로토콜은 프로브와 항체가 림프절에 도달하기 위한 생리적 경로를 제공하며, 피하 투여되고 조직 림프순환을 통해 소멸되기 때문에, situ labeling에 사용된 이전 보고서에 근거하여 림프 관련 구조를 시각화하는 항체8,9,발아 중심 역학10,11,12,혈류에 쉽게 접근할 수 있는 표적13 ,14,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
분자 생물학 및 고차원 면역 phenotyping를 포함하여 그밖 기술과 화상 진찰의 조합은 그들의 본래 문맥에 있는 면역 세포를 조사하는 우리의 기능을 강화했습니다. 사실, 다른 접근법은 조직 소화와 세포 분리를 요구할 수 있지만 – 조직 무결성의 손실로 이어질 수 있습니다 – 생체 내 또는 생체 내 이미징의 사용은 지리적 방식으로 다른 세포 아류형을 조사하는 데 큰 이점을 부여합니다<sup class="xref"…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH (H.L.W.에 R01 AI43458)에 의해 지원되었다.
Materials
| BV421 anti-CD4 | BD Horizon | 562891 | GK1.5; 0.2 mg mL-1 |
| BB515 anti-CD19 | BD Horizon | 564509 | 1D3; 0.2 mg mL-1 |
| BB515 Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Horizon | 564418 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
| BV421 Mouse IgG2b, K Isotype Control | BD Horizon | 562603 | R35-38 0.2 mg mL-1 |
| Cellview culture dish | Greiner-Bio | 627861 | 35×10 mm with glass bottom |
| Insulin syringes | BD Plastipak | – | Insulin U-100 |
| Kimwipes | Kimtech Science Brand | 7557 | size 21 x 20 cm / 100 sheets per box |
| Microsurgery curved forceps | WEP Surgical Instruments | custom made | 12.5 cm |
| Microsurgery curved scissors | WEP Surgical Instruments | custom made | 11.5 cm |
| Needle | BD PrecisionGlide | – | 30 gauge × ½ inch |
| Nikon Eclipse Te + A1R confocal head | Nikon | – | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
| PE anti-F4/80 | BD Pharmigen | 565410 | T45-2342; 0.2 mg mL-1 |
| PE Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Pharmigen | 553930 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
| Zeiss LSM 710 confocal microscope | Zeiss | – | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
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