Visualisera lymfkörtel struktur och cellulär lokalisering med ex-vivo konfokalmikroskopi
Summary
Detta protokoll beskriver en teknik för att avbilda olika cellpopulationer i dränerande lymfkörtlar utan förändringar i orgel strukturen.
Abstract
Lymfkörtlar (LNs) är organ spridda i kroppen, där den medfödda immunsvaret kan ansluta med den adaptiva immunitet. I själva verket, LNS är strategiskt inföll i vägen för lymfkärlen, så intim kontakt av vävnad antigen med alla bosatta immunceller i LN. Sålunda, förstå den cellulära sammansättning, distribution, plats och interaktion med ex vivo hela LN Imaging kommer att lägga till kunskap om hur kroppen samordnar lokala och systemiska immunsvar. Detta protokoll visar en ex vivo Imaging strategi efter en in vivo administrering av fluorescerande-märkta antikroppar som möjliggör en mycket reproducerbar och lätt att utföra metodik med hjälp av konventionella konfokala Mikroskop och lager reagenser. Genom subkutan injektion av antikroppar, är det möjligt att märka olika cellpopulationer i dränering LNs utan att påverka vävnads strukturer som kan potentiellt skadas av en konventionell immunofluorescensmikroskopi teknik.
Introduction
Lymfkörtlar (LNs) är ovoid-formade organ brett närvarande i hela kroppen med den avgörande funktionen att överbrygga den medfödda och adaptiva immunsvar. LNs filtrera lymfa för att identifiera främmande partiklar och cancerceller att montera ett immunsvar mot dem1. Antigen presenterande celler (APCs), T-celler och B-celler fungerar parallellt för att generera antigen-specifika antikroppar (humorala immunitet) och cytotoxiska lymfocyter (cellulära immunitet) för att eliminera främmande partiklar och cancerceller2. Således, förstå dynamiken i immunceller som finns i lymfsystemet kommer att få viktiga konsekvenser för vaccinutveckling och cancer immunterapi.
Tillkomsten av kraftfulla Mikroskop-inklusive nya konfokala och super resolution Mikroskop-har tillåtit en extraordinär avancemang att förstå hur olika immunceller populationer beter sig i sin egen miljö3. Det är nu möjligt att avbilda flera samtidiga cell subtyper med hjälp av en kombination av sonder med genetiskt modifierade möss som uttrycker fluorescerande proteiner under kontroll av specifika mål4,5. I själva verket, hög dimensionell teknik, inklusive masscytometri och multi-parametriska Flödesanalys har varit avgörande för att utvidga vår kunskap om olika immun Celluppdelning och funktionalitet i hälsa och sjukdom6, 7. för att förbereda prover för dessa tekniker behöver vävnader dock matsmältningen och cellerna separeras från sin naturliga miljö för att analyseras i cellsuspensioner. För att överträffa dessa begränsningar och möjliggöra en bättre översättning i biologi, målet med det protokoll som föreslås här är att tillämpa en enkel metod för bild ex vivo hela lymfkörtlar med hjälp av lager konfokala Mikroskop med fördelen av förbättrad hastighet, vävnad struktur bevarande och cellviabilitet jämfört med konventionell immunofluorescensfärgning. Genom att använda denna metod, kunde vi visa att möss bristfällig för känner T-celler, en subtyp av T-lymfocyter inblandade i värd tidigt försvar mot patogener4, har komprometterat folliklar och T cell zoner jämfört med Wild typ möss. Dessa fynd tillät oss att fullfölja en studie där vi visade att känner T-celler spelar en avgörande roll i homeostasen av lymfoida organ och humorala immunsvar4. Dessutom ger detta protokoll en fysiologisk väg för sonder och antikroppar för att nå lymfkörtlarna, eftersom de administreras subkutant och försvinna genom vävnad lymfcirkulationen, bygger på tidigare rapporter som används i situ-märkning med antikroppar för att visualisera lymfatiska-associerade strukturer8,9, avelsmaterial Center Dynamics10,11,12, och mål lättillgängliga för blodflödet13 ,14,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kombinationen av avbildning med andra tekniker, inklusive molekylärbiologi och hög dimensionell immunophenotypning har förbättrat vår förmåga att undersöka immunceller i sitt eget sammanhang. I själva verket, medan andra metoder kan kräva vävnadsnedbrytning och cell isolering – vilket kan leda till förlust av vävnad integritet-användning av in vivo eller ex vivo avbildning ger en stor fördel i att undersöka olika cell subtyper på ett geografiskt sätt3 , <sup class="x…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av NIH (R01 AI43458 till H.L.W.).
Materials
| BV421 anti-CD4 | BD Horizon | 562891 | GK1.5; 0.2 mg mL-1 |
| BB515 anti-CD19 | BD Horizon | 564509 | 1D3; 0.2 mg mL-1 |
| BB515 Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Horizon | 564418 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
| BV421 Mouse IgG2b, K Isotype Control | BD Horizon | 562603 | R35-38 0.2 mg mL-1 |
| Cellview culture dish | Greiner-Bio | 627861 | 35×10 mm with glass bottom |
| Insulin syringes | BD Plastipak | – | Insulin U-100 |
| Kimwipes | Kimtech Science Brand | 7557 | size 21 x 20 cm / 100 sheets per box |
| Microsurgery curved forceps | WEP Surgical Instruments | custom made | 12.5 cm |
| Microsurgery curved scissors | WEP Surgical Instruments | custom made | 11.5 cm |
| Needle | BD PrecisionGlide | – | 30 gauge × ½ inch |
| Nikon Eclipse Te + A1R confocal head | Nikon | – | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
| PE anti-F4/80 | BD Pharmigen | 565410 | T45-2342; 0.2 mg mL-1 |
| PE Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Pharmigen | 553930 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
| Zeiss LSM 710 confocal microscope | Zeiss | – | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
Referências
- Willard-Mack, C. L. Normal structure, function, and histology of lymph nodes. Toxicologic Pathology. 34, 409-424 (2006).
- Tas, J. M., et al. Visualizing antibody affinity maturation in germinal centers. Science. 351, 1048-1054 (2016).
- David, B. A., et al. Combination of Mass Cytometry and Imaging Analysis Reveals Origin, Location, and Functional Repopulation of Liver Myeloid Cells in Mice. Gastroenterology. 151, 1176-1191 (2016).
- Rezende, R. M., et al. gammadelta T cells control humoral immune response by inducing T follicular helper cell differentiation. Nature Communications. 9, 3151 (2018).
- Nakagaki, B. N., et al. Generation of a triple-fluorescent mouse strain allows a dynamic and spatial visualization of different liver phagocytes in vivo. Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 91 (suppl 1), e20170317 (2019).
- Ajami, B., et al. Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models. Nature Neuroscience. 21, 541-551 (2018).
- Becher, B., et al. High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system. Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).
- McElroy, M., et al. Fluorescent LYVE-1 antibody to image dynamically lymphatic trafficking of cancer cells in vivo. Journal of Surgical Research. 151, 68-73 (2009).
- Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity. The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).
- Hauser, A. E., et al. Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns. Immunity. 26, 655-667 (2007).
- Allen, C. D., Okada, T., Tang, H. L., Cyster, J. G. Imaging of germinal center selection events during affinity maturation. Science. 315, 528-531 (2007).
- Arnon, T. I., Horton, R. M., Grigorova, I. L., Cyster, J. G. Visualization of splenic marginal zone B-cell shuttling and follicular B-cell egress. Nature. 493, 684-688 (2013).
- Sipkins, D. A., et al. In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment. Nature. 435, 969-973 (2005).
- Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W., Cyster, J. G. Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport. Nature Immunology. 9, 54-62 (2008).
- Pereira, J. P., An, J., Xu, Y., Huang, Y., Cyster, J. G. Cannabinoid receptor 2 mediates the retention of immature B cells in bone marrow sinusoids. Nature Immunology. 10, 403-411 (2009).
- Nakagaki, B. N., et al. Immune and metabolic shifts during neonatal development reprogram liver identity and function. Journal of Hepatology. (6), 1294-1307 (2018).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
- Roozendaal, R., et al. Conduits mediate transport of low-molecular-weight antigen to lymph node follicles. Immunity. 30, 264-276 (2009).
- Sarder, P., et al. All-near-infrared multiphoton microscopy interrogates intact tissues at deeper imaging depths than conventional single- and two-photon near-infrared excitation microscopes. Journal of Biomedical Optics. 18, 106012 (2013).
