Bu protokol, organ yapısında değişiklik olmadan lenf düğümlerini boşaltmada farklı hücre popülasyonlarını görüntüleyen bir tekniği tanımlar.
Lenf düğümleri (LNs) organlar vücuda yayılmış, doğuştan gelen bağışıklık yanıtları adaptif bağışıklık ile bağlayabilirsiniz nerede. Aslında, LNs stratejik lenfdamarların yolunda interposed, LN tüm yerleşik bağışıklık hücreleri ile doku antijenleri samimi temas sağlayan. Böylece, hücresel kompozisyon, dağılım, yer ve etkileşim ex vivo bütün LN görüntüleme kullanarak anlamak vücudun yerel ve sistemik bağışıklık yanıtları koordine nasıl bilgi katacak. Bu protokol, geleneksel konfokal mikroskoplar ve stok reaktifleri kullanılarak çok tekrarlanabilir ve kolay bir metodoloji sağlayan floresan etiketli antikorların in vivo uygulamasının ardından bir ex vivo görüntüleme stratejisi göstermektedir. Antikorların deri altı enjeksiyonu ile, geleneksel immünoreskans mikroskobu tekniği ile potansiyel olarak zarar görebilir doku yapılarını etkilemeden, nn’lerin boşaltılmasında farklı hücre popülasyonlarının etiketedilmesi mümkündür.
Lenf düğümleri (LNs) doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık yanıtları köprü önemli işlevi ile vücutta yaygın olarak mevcut oval şekilli organlardır. NNs yabancı parçacıklar ve kanserli hücreleri tanımlamak için onlara karşı bir bağışıklık yanıtı monte etmek için lenf filtre1. Antijen sunan hücreler (AAP’ ler), T hücreleri ve B hücreleri yabancı parçacıkları ve kanserli hücreleri ortadan kaldırmak için antijene özgü antikorlar (humoral bağışıklık) ve sitotoksik lenfositler (hücresel bağışıklık) oluşturmak için birlikte çalışır2. Böylece, lenfatik sistemde mevcut bağışıklık hücrelerinin dinamikleri anlamak aşı gelişimi ve kanser immünoterapisi için önemli etkileri olacaktır.
Yeni konfokal ve süper çözünürlüklü mikroskoplar da dahil olmak üzere güçlü mikroskopların ortaya çıkışı, farklı bağışıklıkhücre popülasyonlarının doğal ortamlarında nasıl davranışlarını anlamada olağanüstü bir ilerleme sağladı 3. Floresan proteinleri belirlihedeflerinkontrolü altında ifade eden genetiği değiştirilmiş farelerle sondaların bir kombinasyonunu kullanarak birkaç eşzamanlı hücre alt tipini görüntülemek artık mümkün . Aslında, kitle sitometri ve multi-parametrik akış analizi de dahil olmak üzere yüksek boyutlu teknikler, sağlık ve hastalık 6 farklı bağışıklık hücresi bölümleme ve işlevsellik hakkındaki bilgimizi genişletmek için çok önemli olmuştur6, 7. Ancak, bu teknikler için örnek hazırlamak için, dokular sindirim gerekir ve hücreler hücre süspansiyonları analiz edilecek doğal ortamdan ayrılır. Bu sınırlamaları aşmak ve biyolojide daha iyi bir çeviri sağlamak için, burada önerilen protokolün amacı gelişmiş hız, doku yararı ile stok konfokal mikroskoplar kullanarak ex vivo bütün lenf düğümleri görüntü için basit bir metodoloji uygulamaktır konvansiyonel immünoffloresan boyama ile karşılaştırıldığında yapı koruma ve hücre canlılığı. Bu yaklaşımı kullanarak, γδ T hücreleri için eksik fareler göstermek başardık, Patojenlere karşı konak erken savunmadahil T lenfosit bir alt türü 4, yabani tip fareler ile karşılaştırıldığında folikülleri ve T hücre bölgeleri tehlikeye var. Bu bulgular, γδ T hücrelerinin lenfoid organların homeostazında ve humoral immün yanıtta kritik bir rol oynadığını gösterdiğimiz bir çalışma sürdürmemizi sağladı4. Ayrıca, bu protokol, sondalar ve antikorlar lenf düğümü ulaşmak için fizyolojik bir yol sağlar, onlar deri altı uygulanır ve doku lenfatik dolaşım yoluyla dağıtmak gibi, yerinde etiketleme kullanılan önceki raporlar üzerine bina lenfatik ilişkili yapıları görselleştirmek için antikorlar ile8,9, germinal merkezi dinamikleri10,11,12, ve hedefleri kolayca kan akışı için erişilebilir13 ,14,15.
Moleküler biyoloji ve yüksek boyutlu immünofenotiotipleme de dahil olmak üzere diğer teknikler ile görüntüleme kombinasyonu kendi doğal bağlamda bağışıklık hücrelerini araştırmak için yeteneğimizi geliştirdi. Aslında, diğer yaklaşımlar doku sindirimi ve hücre izolasyonu gerektirebilir iken – doku bütünlüğünün kaybına yol açabilir – in vivo veya ex vivo görüntüleme kullanımı coğrafi bir şekilde farklı hücre alt tipleri araştırmada büyük bir avantaj sağlar3<…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma NIH (R01 AI43458 – H.L.W.) tarafından desteklenmiştir.
BV421 anti-CD4 | BD Horizon | 562891 | GK1.5; 0.2 mg mL-1 |
BB515 anti-CD19 | BD Horizon | 564509 | 1D3; 0.2 mg mL-1 |
BB515 Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Horizon | 564418 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
BV421 Mouse IgG2b, K Isotype Control | BD Horizon | 562603 | R35-38 0.2 mg mL-1 |
Cellview culture dish | Greiner-Bio | 627861 | 35×10 mm with glass bottom |
Insulin syringes | BD Plastipak | – | Insulin U-100 |
Kimwipes | Kimtech Science Brand | 7557 | size 21 x 20 cm / 100 sheets per box |
Microsurgery curved forceps | WEP Surgical Instruments | custom made | 12.5 cm |
Microsurgery curved scissors | WEP Surgical Instruments | custom made | 11.5 cm |
Needle | BD PrecisionGlide | – | 30 gauge × ½ inch |
Nikon Eclipse Te + A1R confocal head | Nikon | – | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |
PE anti-F4/80 | BD Pharmigen | 565410 | T45-2342; 0.2 mg mL-1 |
PE Rat IgG2a, κ Isotype Control | BD Pharmigen | 553930 | R35-95; 0.2 mg mL-1 |
Zeiss LSM 710 confocal microscope | Zeiss | – | loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm) |