JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Pesquisa do Câncer

Een Orthothematisch endometriumkanker model met Retroperitoneale lymfadenopathie gemaakt van in vivo gepropageerd en gekweekte VX2 cellen

Published: September 12, 2019
doi:
10.3791/59340
, , , , , , , , ,
1Institute of Medical Science,University of Toronto, 2Department of Obstetrics and Gynecology,University of Toronto, 3Guided Therapeutics Laboratory, TECHNA Institute,University Health Network, 4Department of Pathology, Princess Margaret Cancer Center,University Health Network, 5Department of Medical Biophysics,University of Toronto, 6Princess Margaret Cancer Center,University Health Network, 7Techna Institute,University Health Network, 8Department of Surgery,University of Toronto, 9Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery,University of Toronto, 10Division of Gynecologic Oncology, University of Toronto /Princess Margaret Cancer Center,University Health Network, 11Princess Margaret Cancer Center,University Health Network

Summary

Dit protocol presenteert een gestandaardiseerde methode om te groeien VX2 cellen in de cultuur en om een orthotopic VX2 model van endometriumkanker met retroperitoneale lymfeklier metastasen bij konijnen te creëren. Orthotopic endometriumkanker modellen zijn belangrijk voor de pre-klinische studie van nieuwe beeldvormings modaliteiten voor de diagnose van lymfeklier metastasen.

Abstract

Endometriumkanker is de meest voorkomende gynecologic maligniteit in Noord-Amerika en de incidentie stijgt wereldwijd. De behandeling bestaat uit chirurgie met of zonder adjuvante therapie, afhankelijk van de lymfeklier-betrokkenheid zoals bepaald door lymfadenectomie. Lymfadenectomie is een morbide procedure, waarvan niet is aangetoond dat het een therapeutisch voordeel heeft bij veel patiënten, en daarom is een nieuwe methode vereist om lymfeklier metastasen te diagnosticeren. Om nieuwe beeldvormings middelen te testen, is een betrouwbaar model van endometriumkanker met retroperitoneale lymfeklier metastasen nodig. Het VX2 endometriumkanker model is vaak beschreven in de literatuur; Er bestaat echter een aanzienlijke variatie met betrekking tot de methode van model inrichting. Bovendien, geen studies hebben gemeld over het gebruik van gekweekte VX2 cellen om dit model te maken als alleen cellen die zijn gekweekt in vivo eerder zijn gebruikt. Hierin presenteren we een gestandaardiseerde chirurgische methode en post-operatieve bewakingsmethode voor de oprichting van het VX2 endometriumkanker model en rapporteren over het eerste gebruik van gekweekte VX2 cellen om dit model te maken.

Introduction

Endometriumkanker, of kanker van de bekleding van de baarmoeder, is de tweede meest voorkomende gynecologic maligniteit wereldwijd en de meest voorkomende maligniteit in ontwikkelde landen1. De incidentie van endometriumkanker is gestaag toegenomen en stijgt met 2,3% per jaar tussen 2005-2013 en een overeenkomstige toename van 2,2% in sterfte1,2,3. De diagnose van lymfeklier metastasen is van het grootste belang omdat de aanwezigheid van positieve lymfeklieren een sterke negatieve voorspeller is van overleving4,5,6,7 en kan leiden tot de toediening van adjuvante therapie8,9,10,11,12,13. Lymfeklier metastasen worden momenteel gediagnosticeerd door chirurgisch verwijderen van het lymfeweefsel boven de grote bloedvaten in het bekken en de buik. Deze procedure, bekend als een lymfadenectomie, is controversieel als gevolg van conflicterende overlevings gegevens van twee grote proeven14,15,16,17,18 en de bekende risico van intra-operatieve15,19,20 en postoperatieve morbiditeit21,22,23. Aangezien de huidige niet-invasieve beeldvormings modaliteiten niet de vereiste gevoeligheid en specificiteit hebben om lymfeklier dissectie24te vervangen, is er een duw geweest om nieuwe diagnostische beeldvormingstechnieken te ontwikkelen. Om deze nieuwe technieken te testen in een pre-klinische setting, is een betrouwbaar model van endometriumkanker met retroperitoneale lymfeklier metastasen vereist.

Het konijn VX2 tumor model is een gevestigde model dat uitgebreid is gebruikt voor het bestuderen van meerdere menselijke solide orgel tumoren25 met inbegrip van Long26, hoofd ennek 27,28, lever29, nier30, bot31,32, hersenen33, alvleesklier34 en baarmoeder35,36,37. Het VX2 model werd oorspronkelijk ontwikkeld in 1940 door Kidd en Rous38 door het succesvol verplanten van een Cottontail konijn papillomavirus virus ontdekt door shope in 193339. Sinds die tijd is het VX2-model in vivo gehandhaafd, waarbij seriële passage in de quadriceps spier van witte Nieuw-Zeelandse konijnen40nodig is. Meer recent echter, meerdere groepen hebben succesvol gegroeid VX2 cellen in vitro40,41,42 en toonde de behouden tumorigenecity van de gekweekte cellijn lijn31, 42,43. VX2 tumoren zijn histologisch gedefinieerd als anaplastisch plaveiselcel carcinomen44 en bevatten klierweefsel kenmerken die lijken op adenocarcinoom26. Tumoren worden gekenmerkt door het gemak van implantatie, snelle groei en Hyper-vasculariteit44,45 en betrouwbaar metastasize, meestal op regionale en verre lymfeklieren45. Overeenkomsten in de baarmoeder vasculaire en lymfatische anatomie46 evenals de orthotopic groeiplaats zorgen ervoor dat het metastatische patroon van konijn VX2 carcinoom dat van humaan endometriumkanker nabootst, waardoor het VX2 model een betrouwbaar model is voor het bestuderen van menselijke gemetastaseerde ziekte. Bovendien suggereren histologische kenmerken zoals abnormale microvasculaire proliferatie47 , evenals immunologische48 en genetische gelijkenissen49,50 tussen mensen en konijnen dat de tumor micro-omgeving kan weerspiegelen die van humaan endometriumkanker.

Meerdere groepen hebben gerapporteerd over het gebruik van VX2 te maken van een model van endometriumkanker met retroperitoneale metastasen met een hoge gerapporteerde succespercentage36,51,52; Er bestaat echter een aanzienlijke variatie in de huidige literatuur met respect voor de methode van model creatie. Cel schorsing doses zo laag als 4 x 105 cellen/baarmoeder hoorn51 en zo hoog als 5 x 109 cellen/baarmoeder hoorn37,53 zijn gemeld met geen standaard consensus over de vereiste VX2 cellulaire dosis. Ook is er een verscheidenheid aan inoculatie methoden gemeld, waaronder micro-chirurgische implantatie van tumor in de baarmoeder myometrium36, injectie van VX2 celsuspensie37,44,52 , 53 en in sommige gevallen, de toevoeging van baarmoeder hoorn voorafgaand aan de en52. Ten slotte hebben geen groepen het gebruik van gekweekte VX2 cellen gemeld om dit model te maken. Het doel van deze studie is dus om een succesvolle gestandaardiseerde methode van VX2 model creatie te demonstreren en het eerste gebruik van gekweekte VX2 cellen te rapporteren om een model van endometriumkanker met retroperitoneale metastasen in een konijn te creëren.

Protocol

Diepe buikwand sluiting: Identificeer de Apex van de peritoneale incisie en pak het peritoneum, rectus spier en fascia met weefsel Tang. Alle dierproeven zijn uitgevoerd in een Animal Resource Center (ARC) goedgekeurde faciliteiten van het universitair gezondheidsnetwerk en in overeenstemming met de goedgekeurde protocollen voor dieren gebruik en zorg (AUP #3994/#4299). VX2 cellijn werd verkregen uit het lab van Dr. Aken in het universitair gezondheidsnetwerk. 1. creatie van in vitro VX2 cellijn…

Representative Results

Achtentwintig konijnen werden gebruikt voor de creatie van het endometriumkanker model. Konijnen hadden een gemiddeld gewicht van 2,83 kg (2.71-3.58 kg) op het moment van het experiment. Baarmoeder tumoren succesvol gegroeid in 21 konijnen voor een algemeen model succespercentage van 75%. Voordat de baarmoeder in het protocol werd opgenomen, bedroeg het slagingspercentage 57% in vergelijking met 81% na toevoeging van baarmoeder-hechten. Baarmoeder hechten werd toegevoegd aan het protocol …

Discussion

Hierin hebben we een gestandaardiseerde chirurgische methode voor de oprichting van een VX2 endometriumkanker model gerapporteerd en gerapporteerd over het eerste gebruik van gekweekte VX2 cellen om dit model te maken. De tumor nemen tarief van 75% is lager dan de 100% percentage eerder gerapporteerd in de literatuur35,37,53,56; echter, thw 90% snelheid van pathologisch bevestigde lymfeklier me…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Deze studie werd gefinancierd door het Terry Fox Research Institute (PPG # 1075), het Canadian Institute of Health Research (Foundation Grant #154326), het Canadian Cancer Society Research Institute (704718), natuurwetenschappen en ingenieurs Onderzoekraad van Canada, Stichting сanada voor innovatie en Prinses Margaret Cancer Foundation.

Ik wil Dr. Marguerite Akens bedanken voor het leveren van de initiële VX2 cellen voor de oprichting van het oorspronkelijke VX2 model en de bevroren VX2 tumor blokken. Ik wil Marco DiGrappa bedanken voor het helpen bij het uitvoeren van initiële VX2 Cell Culture experimenten en Lili ding voor het helpen met VX2 celcultuur.

Materials

11-blade scalpel, Sterile, Disposible Aspen Surgical (VWR) 80094-086
22-gague ear vein catheter CDMV 14332
3-0 absorbable poly-filament suture (Polysorb) Covidien 356718
3-0 braided absorbable suture (Polysorb) Covidien 356718
70uM cell strainer, Individually wrapped, Nylon Falcon 352350
Acepromazine (Atravet) CDMV 1047
Betadine soap (Poviodone iodine 7.5%) CDMV 4363
Betadine solution (Poviodone iodine 10%) UHN Stores 457955
Buprenorphine McGill University
Cefazolin UHN in-patient pharmacy No Cat # Needed
Chlorhexidine solution CDMV 119872
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 100mm dishes Corning 354450 brand not important
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 24-well plates Corning 354408 brand not important
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 6-well plates Corning 354400 brand not important
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, *LDEV-free, 10 mL Corning 354234
DMEM/HAM F12 1:1 Life Technologies 11320 brand not important
DMSO Caledon Lab Chem 1/10/4100
Enrofloxacin (Baytril injectable) CDMV 11242
Falcon Tube Corning Centri-Star 430828
Fetal Bovine Serum, Qualified, Canadian Origin, 500ml Life Technologies 12483020 brand/source not important
Isoflurane UHN in-patient pharmacy No Cat # Needed
Isohexol contrast GE Healthcare 407141210
Meloxicam (Metacam 0.5%) CDMV 104674
Normal Saline House Brand (UofT Medstore) 1011
PBS Multicell or Sigma 331-010-CL or D8537-500mL
Penicillin/Streptomycin (100mL; 10000U Penicillin, 10000ug Streptomycin) Corning-Cellgro CA45000-652
Sterile Hanks Balanced Salt Solution (-Ca++, -Mg++, -Phenol Red) T.C.M.F (Dr Bristow) 28-Jan-11
Surgical Glue (Tissue Adhesive) 3M Vetbond 14695B
Trypsin (0.25%), Proteomics Grade Sigma T-6567-5X20UG
Trypsin-EDTA, 0.05%, 100ml Wisent Inc 325-542-EL brand not important
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: Sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. International Journal of Cancer. 136, E359-E386 (2015).
  2. Canada, S. . Canadian Cancer Statistics Special topic: Pancreatic cancer. , (2017).
  3. Siegel, R. Cáncer Statistics. Cáncer Journal. 67, 7-30 (2017).
  4. Creasman, W. T., et al. Surgical pathologic spread patterns of endometrial cancer. A Gynecologic Oncology Group Study. Cancer. 60, 2035-2041 (1987).
  5. Morrow, C. P., et al. Relationship between surgical-pathological risk factors and outcome in clinical stage I and II carcinoma of the endometrium: A gynecologic oncology group study. Gynecologic Oncology. 40, 55-65 (1991).
  6. Hicks, M., et al. The National Cancer Data Base report on Endometrial carcinoma in African-American women. Cancer. 83, 2629-2637 (1998).
  7. Barrena Medel, N. I., et al. Comparison of the prognostic significance of uterine factors and nodal status for endometrial cancer. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 204, 1-7 (2011).
  8. Randall, M. E., et al. Randomized phase III trial of whole-abdominal irradiation versus doxorubicin and cisplatin chemotherapy in advanced endometrial carcinoma: A gynecologic oncology group study. Journal of Clinical Oncology. 24, 36-44 (2006).
  9. Galaal, K., Al Moundhri, M., Bryant, A., Lopes, A. D., Lawrie, T. A. Adjuvant chemotherapy for advanced endometrial cancer. Cochrane Database of Systematic Reviews. 2014, 2-4 (2014).
  10. Orr, J. W., Holimon, J. L., Orr, P. F. Stage I corpus cancer: is teletherapy necessary?. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 176, 777-788 (1997).
  11. Ng, T. Y., Perrin, L. C., Nicklin, J. L., Cheuk, R., Crandon, A. J. Local recurrence in high-risk node-negative stage I endometrial carcinoma treated with postoperative vaginal vault brachytherapy. Gynecologic Oncology. 79, 490-494 (2000).
  12. Mohan, D. S., et al. Long-term outcomes of therapeutic pelvic lymphadenectomy for stage I endometrial adenocarcinoma. Gynecologic Oncology. 70, 165-171 (1998).
  13. Straughn, J. M., et al. Stage IC adenocarcinoma of the endometrium: Survival comparisons of surgically staged patients with and without adjuvant radiation therapy. Gynecologic Oncology. 89, 295-300 (2003).
  14. Panici, P. B., et al. Systematic pelvic lymphadenectomy vs no lymphadenectomy in early-stage endometrial carcinoma: Randomized clinical trial. Journal of the National Cancer Institute. 100, 1707-1716 (2008).
  15. ASTEC study group, ., et al. Efficacy of systematic pelvic lymphadenectomy in endometrial cancer (MRC ASTEC trial): a randomised study. The Lancet. 373, 125-126 (2009).
  16. Kilgore, L., et al. Adenocarcinoma of the Endometrium: Survival comparisons of patients with and without pelvic node sampling. Gynecologic Oncology. 56, 29-33 (1995).
  17. Trimble, E. L., Kosary, C., Park, R. C. Lymph node sampling and survival in endometrial cancer. Gynecologic Oncology. 71, 340-343 (1998).
  18. Chan, J. K., et al. The outcomes of 27,063 women with unstaged endometrioid uterine cancer. Gynecologic Oncology. 106, 282-288 (2007).
  19. Cragun, J. M., et al. Retrospective analysis of selective lymphadenectomy in apparent early-stage endometrial cancer. Journal of Clinical Oncology. 23, 3668-3675 (2005).
  20. Piovano, E., et al. Complications after the treatment of endometrial cancer: A prospective study using the French-Italian glossary. International Journal of Gynecological Cancer. 24, 418-426 (2014).
  21. Abu-Rustum, N. R., et al. The incidence of symptomatic lower-extremity lymphedema following treatment of uterine corpus malignancies: A 12-year experience at Memorial Sloan-Kettering Cancer Center. Gynecologic Oncology. , 714-718 (2006).
  22. Todo, Y., et al. Risk factors for postoperative lower-extremity lymphedema in endometrial cancer survivors who had treatment including lymphadenectomy. Gynecologic Oncology. 119, 60-64 (2010).
  23. Beesley, V., Janda, M., Eakin, E., Obermair, A., Battistutta, D. Lymphedema after gynecological cancer treatment: Prevalence, correlates, and supportive care needs. Cancer. 109, 2607-2614 (2007).
  24. Haldorsen, I. S., Salvesen, H. B. What Is the Best Preoperative Imaging for Endometrial Cancer?. Current Oncology Reports. 18, 1-11 (2016).
  25. Aravalli, R., Cressman, E. Relevance of Rabbit VX2 Tumor Model for Studies on Human Hepatocellular Carcinoma: A MicroRNA-Based Study. Journal of Clinical Medicine. 4, 1989-1997 (2015).
  26. Kreuter, K. A., et al. Development of a rabbit pleural cancer model by using VX2 tumors. Comparative Medicine. 58, 287-293 (2008).
  27. Li, S., Ren, G., Jin, W., Guo, W. Establishment and characterization of a rabbit oral squamous cell carcinoma cell line as a model for in vivo studies. Oral Oncology. 47, 39-44 (2011).
  28. Muhanna, N., et al. Multimodal Nanoparticle for Primary Tumor Delineation and Lymphatic Metastasis Mapping in a Head-and-Neck Cancer Rabbit Model. Advanced Healthcare Materials. 4, 2164-2169 (2015).
  29. Tong, H., Duan, L., Zhou, H., Feng, S. Modification of the method to establish a hepatic VX2 carcinoma model in rabbits. Oncology Letters. 15, 22-23 (2018).
  30. Bimonte, S., et al. Induction of VX2 para-renal carcinoma in rabbits: generation of animal model for loco-regional treatments of solid tumors. Infectious Agents and Cancer. 11, 1-8 (2016).
  31. Handal, J. A., et al. Creation of rabbit bone and soft tissue tumor using cultured VX2 cells. Journal of Surgical Research. 179, e127-e132 (2013).
  32. Pezeshki, P. S., et al. Bone targeted bipolar cooled radiofrequency ablation in a VX-2 rabbit femoral carcinoma model. Clinical and Experimental Metastasis. 32, 279-288 (2015).
  33. Wang, Y., et al. Magnetic resonance imaging-navigated argon-helium cryoablation therapy against a rabbit VX2 brain tumor. Experimental and Therapeutic. 9, 2229-2234 (2015).
  34. Zhang, W., et al. Laparotomy cryoablation in rabbit VX2 pancreatic carcinoma. Pancreas. 46, 288-295 (2017).
  35. Xu, L. -. Q., Huang, Y. -. W., Luo, R. -. Z., Zhang, Y. -. N. Establishment of the retroperitoneal lymph node metastasis model of endometrial VX2 carcinoma in rabbits and observation of its metastatic features. World Journal of Surgical Oncology. 13, 109 (2015).
  36. Duan, P., Lü, J. Q., Tu, Q. M., Yu, Z. K. Magnetic resonance evaluation of transplanted endometrial carcinoma and its lymph node metastasis in rabbits. Chinese Journal of Cancer Research. 19, 201-205 (2007).
  37. Huang, Y. -. W., et al. VEGF-c expression in an in vivo model of orthotopic endometrial cancer and retroperitoneal lymph node metastasis. Reproductive Biology and Endocrinology. 11, 49 (2013).
  38. Kidd, J. G., Rous, P. A transplantable rabbit carcinoma originating in a virus-induced papilloma and containing the virus in masked or altered form. J Exp Med. 71 (6), 813-838 (1940).
  39. Shope, B. R. E., Hurst, B. E. W. . Infectious papillomatosis of rabbits. , (1933).
  40. Galasko, C. S. B., Haynes, D. W. Survival of VX2 carcinoma cells in vitro. European Journal of Cancer. 12 (1965), 1025-1026 (1965).
  41. Osato, B. Y. T., Ito, Y. . In vitro Cultivation And Immunofluorescent Studies Of Transplantable Carcinomas Vx2 And Vx7. , (1967).
  42. Easty, D. M., Easty, G. C. Establishment of an in vitro cell line from the rabbit VX2 carcinoma. Virchows Archiv B Cell Pathology Including Molecular Pathology. 39, 333-337 (1982).
  43. Liu, X., et al. Establishment and characterization of a rabbit tumor cell line VX2. Zhonghua bing li xue za zhi Chinese Journal of Pathology. 34, 661-663 (2005).
  44. Parvinian, A., Casadaban, L. C., Gaba, R. C. Development, growth, propagation, and angiographic utilization of the rabbit VX2 model of liver cancer: a pictorial primer and “how to” guide. Diagnostic and Interventional Radiology. 20, 335-340 (2014).
  45. Pascale, F., et al. Modified model of VX2 tumor overexpressing vascular endothelial growth factor. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 23, 809-817 (2012).
  46. Oshiro, H. The role of the lymphatic system in rabbit models for cancer metastasis research a perspective from comparative anatomy. Okajimas Folia Anatomica Japonica. , 6-7 (2014).
  47. Guan, L., Xu, G. Destructive effect of HIFU on rabbit embedded endometrial carcinoma tissues and their vascularities. Oncotarget. 8, 19577-19591 (2017).
  48. Oshiro, H., et al. Establishment of successively transplantable rabbit VX2 cancer cells that express enhanced green fluorescent protein. Medical Molecular Morphology. 48, 13-23 (2015).
  49. Graur, D., Duret, L., Gouyt, M. Phylogenetic position of the order Lagomorpha (rabbits, hares and allies). Nature. 379, 333-335 (1996).
  50. Bõsze, Z., Houdebine, L. M. Application of rabbits in biomedical research: A review. World Rabbit Science. 14, 1-14 (2006).
  51. Kyotani, S., et al. A study of cis-diamminedichloroplatinum(II) suppositories for the treatment of rabbit uterine endometrial carcinoma. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 16, 55-58 (1993).
  52. Harima, Y., Harima, K., Hasegawa, T., Shikata, N., Tanaka, Y. Histopathological changes in rabbit uterus carcinoma alter transcatheter arterial embolization using cisplatin. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 38, 317-322 (1996).
  53. Huang, Y. W., et al. Tumor-induced VEGF-C overexpression in retroperitoneal lymph nodes in VX2 carcinoma-bearing rabbits. Drug Design, Development and Therapy. 9, 5949-5956 (2015).
  54. Bio-Rad. . Real-Time PCR Applications Guide. , (2006).
  55. Taylor, S., et al. A practical approach to RT-qPCR—publishing data that conform to the MIQE guidelines. BioRad Bulletin. , 5859 (2009).
  56. Rhee, T. K., et al. Rabbit VX2 Tumors as an Animal Model of Uterine Fibroids and for Uterine Artery Embolization. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 18, 411-418 (2007).
  57. Takahashi, K., et al. Development of a mouse model for lymph node metastasis with endometrial cancer. Cancer Science. 102, 2272-2277 (2011).

Tags

Orthotopic Endometrial Cancer ModelVX2 CellsRetroperitoneal Lymph Node MetastasisImage-guided SurgeryIn Vitro PropagationIn Vivo PropagationCell CultureCell SuspensionCell CountingCell Injection

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Philp, L., Chan, H., Rouzbahman, M., Rostami, A., Ding, L., Bratman, S. V., Akens, M. K., Irish, J. C., Bernardini, M. Q., Zheng, G. An Orthotopic Endometrial Cancer Model with Retroperitoneal Lymphadenopathy Made From In Vivo Propagated and Cultured VX2 Cells. J. Vis. Exp. (151), e59340, doi:10.3791/59340 (2019).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image