Un modèle orthotopic de cancer de l'endomètre avec lymphadénopathie rétropéritonel fabriqué à partir de cellules VX2 propagées et cultivées

Summary

Ce protocole présente une méthode normalisée pour cultiver des cellules VX2 dans la culture et pour créer un modèle orthotopic VX2 du cancer de l’endomètre avec des métastases rétropéritonéales de ganglion lymphatique chez les lapins. Les modèles orthotopiques de cancer de l’endomètre sont importants pour l’étude préclinique des modalités d’imagerie nouvelles pour le diagnostic des métastases de ganglion lymphatique.

Abstract

Le cancer de l’endomètre est la malignité gynécologique la plus courante en Amérique du Nord et l’incidence augmente dans le monde entier. Le traitement consiste en une chirurgie avec ou sans traitement adjuvant en fonction de la participation des ganglions lymphatiques telle que déterminée par lymphadenectomy. Lymphadenectomy est une procédure morbide, qui n’a pas été montrée pour avoir un avantage thérapeutique dans beaucoup de patients, et ainsi une nouvelle méthode pour diagnostiquer des métastases de ganglion lymphatique est exigée. Pour tester de nouveaux agents d’imagerie, un modèle fiable de cancer de l’endomètre avec métastases rétropéritones des ganglions lymphatiques est nécessaire. Le modèle de cancer endomètre vX2 a été décrit fréquemment dans la littérature ; toutefois, il existe des variations importantes en ce qui concerne la méthode d’établissement du modèle. En outre, aucune étude n’a rapporté sur l’utilisation de cellules VX2 cultivées pour créer ce modèle que seules les cellules propagées in vivo ont été précédemment utilisés. Ici, nous présentons une méthode chirurgicale normalisée et une méthode de surveillance postopératoire pour l’établissement du modèle de cancer de l’endomètre VX2 et rapportons sur la première utilisation des cellules VX2 cultivées pour créer ce modèle.

Introduction

Le cancer de l’endomètre, ou cancer de la muqueuse de l’utérus, est la deuxième malignité gynécologique la plus commune dans le monde et la malignité la plus commune dans les nations développées¹. L’incidence du cancer de l’endomètre n’a cessé d’augmenter, augmentant de 2,3 % par an entre 2005 et 2013, avec une augmentation correspondante de 2,2 % de la mortalité^1,2,3. Le diagnostic des métastases de ganglion lymphatique est primordial car la présence des ganglions lymphatiques positifs est un prédicteur négatif fort de la survie^4,5,6^,7et peut guider l’administration de thérapie adjuvante^{8,9,10,11,12,13}. Les métastases des ganglions lymphatiques sont actuellement diagnostiquées en enlevant chirurgicalement le tissu lymphatique qui recense les principaux vaisseaux sanguins du bassin et de l’abdomen. Cette procédure, connue sous le nom de lymphadenectomy, est controversée en raison des données contradictoires de survie de deux grands essais^{14,15,16,17,18} et le connu risque de^15,19,20 et morbidité postopératoire^21,22,23. Comme les modalités actuelles d’imagerie non invasive n’ont pas la sensibilité et la spécificité requises pour remplacer la dissection²⁴des ganglions lymphatiques, il y a eu une poussée pour développer de nouvelles techniques d’imagerie diagnostique. Pour tester ces nouvelles techniques dans un cadre préclinique, un modèle fiable de cancer de l’endomètre avec métastases rétropéritones des ganglions lymphatiques est nécessaire.

Le modèle de tumeur de lapin VX2 est un modèle bien établi qui a été employé intensivement pour étudier les tumeurs pleines humaines multiples d’organe²⁵ comprenant le poumon^26,la tête et le cou^27,28, foie^29,rein^30, os^31,32, cerveau³³, pancréas³⁴ et utérus^35,36,37. Le modèle VX2 a été initialement développé en 1940 par Kidd et Rous³⁸ en transplantant avec succès un virus du papillome de lapin à queue de coton découvert par Shope en 1933³⁹. Depuis lors, le modèle VX2 a été maintenu in vivo, nécessitant un passage en série dans le muscle quadriceps de lapins blancs de Nouvelle-Zélande⁴⁰. Plus récemment cependant, plusieurs groupes ont réussi à cultiver des cellules VX2 in vitro^40,41,42 et a démontré la tumorigénéité retenue de la lignée cellulaire cultivée^{31, 42,43}. Les tumeurs vX2 sont histologiquement définies comme carcinomes squamous anapicieux de cellules⁴⁴ et contiennent des dispositifs glandulaires qui ressemblent à l’adénocarcinome^26. Les tumeurs sont caractérisées par la facilité d’implantation, la croissance rapide et l’hypervascularité^44,45 et métastasé de façon fiable, le plus souvent aux ganglions lymphatiques régionaux et éloignés⁴⁵. Les similitudes dans l’anatomie vasculaire et lymphatique utérine⁴⁶ aussi bien que le site de croissance orthotopic assurent que le modèle métastatique du carcinome de Lapin VX2 imite celui du cancer humain d’endomètre, faisant le modèle de VX2 un modèle fiable pour étudier l’humain métastatique. En outre, les dispositifs histologiques tels que la prolifération microvasculaire anormale^47, aussi bien que les similitudes immunologiques⁴⁸ et génétiques^49,50 entre les humains et les lapins suggèrent que la tumeur microenvironnement peut refléter celui du cancer de l’endomètre humain.

Plusieurs groupes ont fait rapport sur l’utilisation de VX2 pour créer un modèle de cancer de l’endomètre avec métastases rétropéritoéneavecles avec un taux élevé de réussite signalé^36,51,52; cependant, il existe des variations significatives dans la littérature actuelle en ce qui concerne la méthode de création de modèles. Des doses de suspension cellulaire aussi bas que 4 x 10⁵ cellules/corne utérine⁵¹ et aussi haut que 5 x 10⁹ cellules/corne utérine^37,53 ont été rapportées sans consensus standard sur la dose cellulaire VX2 requise. En outre, une série de méthodes d’inoculation ont été rapportées comprenant l’implantation micro-chirurgicale de la tumeur dans le myometrium utérin^36,injection de suspension de cellules de VX2^{37,44,52 , 53} et dans certains cas, l’ajout de la suture de corne utérine avant l’innoculation⁵². Enfin, aucun groupe n’a signalé l’utilisation de cellules VX2 cultivées pour créer ce modèle. Ainsi, le but de cette étude est de démontrer une méthode normalisée réussie de création de modèle de VX2 et de rapporter la première utilisation des cellules cultivées de VX2 pour créer un modèle du cancer d’endomètre avec des métastases rétropéritoéines dans un lapin.

Protocol

Fermeture profonde de la paroi abdominale : Identifiez le sommet de l’incision péritonéale et saisissez le péritoine, le rectus muscle et le fascia avec des forceps de tissu. Toutes les études sur les animaux ont été menées dans des installations approuvées par le Réseau universitaire de santé du Centre de ressources animales (ARC) et conformément aux protocoles approuvés d’utilisation et de soins des animaux (AUP #3994/#4299). La lignée cellulaire VX2 a été obtenue du laboratoire du Dr Aken au Réseau uni…

Representative Results

Vingt-huit lapins ont été utilisés pour la création du modèle du cancer de l’endomètre. Les lapins avaient un poids moyen de 2,83 kg (2,71-3,58 kg) au moment de l’expérience. Les tumeurs utérines ont avec succès grandi dans 21 lapins pour un taux global de succès de modèle de 75%. Avant l’inclusion de la suture utérine dans le protocole, le taux de réussite était de 57% comparé à 81% après que la suture utérine ait été ajoutée. La suture utérine a été ajoutée au p…

Discussion

Ici, nous avons rapporté une méthode chirurgicale normalisée pour l’établissement d’un modèle de cancer de l’endomètre VX2 et rapporté sur la première utilisation des cellules VX2 cultivées pour créer ce modèle. Le taux de prise de tumeur de 75% est inférieur au taux de 100% pour cent précédemment rapporté dans la littérature^35,37,53,56; cependant, thw 90% taux de métastases pa…

Materials

11-blade scalpel, Sterile, Disposible	Aspen Surgical (VWR)	80094-086
22-gague ear vein catheter	CDMV	14332
3-0 absorbable poly-filament suture (Polysorb)	Covidien	356718
3-0 braided absorbable suture (Polysorb)	Covidien	356718
70uM cell strainer, Individually wrapped, Nylon	Falcon	352350
Acepromazine (Atravet)	CDMV	1047
Betadine soap (Poviodone iodine 7.5%)	CDMV	4363
Betadine solution (Poviodone iodine 10%)	UHN Stores	457955
Buprenorphine	McGill University
Cefazolin	UHN in-patient pharmacy	No Cat # Needed
Chlorhexidine solution	CDMV	119872
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 100mm dishes	Corning	354450	brand not important
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 24-well plates	Corning	354408	brand not important
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 6-well plates	Corning	354400	brand not important
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, *LDEV-free, 10 mL	Corning	354234
DMEM/HAM F12 1:1	Life Technologies	11320	brand not important
DMSO	Caledon Lab Chem	1/10/4100
Enrofloxacin (Baytril injectable)	CDMV	11242
Falcon Tube	Corning Centri-Star	430828
Fetal Bovine Serum, Qualified, Canadian Origin, 500ml	Life Technologies	12483020	brand/source not important
Isoflurane	UHN in-patient pharmacy	No Cat # Needed
Isohexol contrast	GE Healthcare	407141210
Meloxicam (Metacam 0.5%)	CDMV	104674
Normal Saline	House Brand (UofT Medstore)	1011
PBS	Multicell or Sigma	331-010-CL or D8537-500mL
Penicillin/Streptomycin (100mL; 10000U Penicillin, 10000ug Streptomycin)	Corning-Cellgro	CA45000-652
Sterile Hanks Balanced Salt Solution (-Ca++, -Mg++, -Phenol Red)	T.C.M.F (Dr Bristow)	28-Jan-11
Surgical Glue (Tissue Adhesive)	3M Vetbond	14695B
Trypsin (0.25%), Proteomics Grade	Sigma	T-6567-5X20UG
Trypsin-EDTA, 0.05%, 100ml	Wisent Inc	325-542-EL	brand not important