Dieses Protokoll stellt eine standardisierte Methode zum Wachstum von VX2-Zellen in Kultur dar und zur Erstellung eines orthotopischen VX2-Modells von Endometriumkrebs mit retroperitonealen Lymphknotenmetastasen bei Kaninchen. Orthotopische Endometriumkrebsmodelle sind wichtig für die präklinische Untersuchung neuartiger bildgebender Modalitäten für die Diagnose von Lymphknotenmetastasen.
Endometriumkrebs ist die häufigste gynäkologische Malignität in Nordamerika und die Inzidenz steigt weltweit. Die Behandlung besteht aus einer Operation mit oder ohne adjuvante Therapie in Abhängigkeit von lymphen Knoten Beteiligung, wie durch Lymphadenektomie bestimmt. Lymphadenektomie ist ein morbides Verfahren, das bei vielen Patienten keinen therapeutischen Nutzen hat, und daher ist eine neue Methode zur Diagnose von Lymphknotenmetastasen erforderlich. Um neuartige Bildgebungsmittel zu testen, ist ein zuverlässiges Modell von Endometriumkrebs mit retroperitonealen Lymphknotenmetastasen erforderlich. Das Modell des VX2-Endometriumkarzinoms wurde häufig in der Literatur beschrieben; Hinsichtlich der Methode der Modelleinrichtung bestehen jedoch erhebliche Unterschiede. Darüber hinaus wurden keine Studien über die Verwendung kultivierter VX2-Zellen zur Erstellung dieses Modells berichtet, da bisher nur in vivo propagierte Zellen verwendet wurden. Hierbei stellen wir eine standardisierte chirurgische Methode und postoperative Überwachungsmethode zur Etablierung des VX2-Endometriumkrebsmodells vor und berichten über die erste Verwendung kultivierter VX2-Zellen zur Erstellung dieses Modells.
Endometriumkrebs, oder Krebs der Gebärmutterschleimhaut, ist die zweithäufigste gynäkologische Malignität weltweit und die häufigste Malignität in entwickelten Ländern1. Die Inzidenz von Endometriumkrebs hat stetig zugenommen und ist zwischen 2005 und 2013 um 2,3 % pro Jahr gestiegen, wobei die Sterblichkeit entsprechend um 2,2 % gestiegen ist1,2,3. Die Diagnose von Lymphknotenmetastasen ist von größter Bedeutung, da das Vorhandensein positiver Lymphknoten ein starker negativer Vorhersagegeber für das Überleben4,5,6,7 ist und die adjuvante Therapie8,9,10,11,12,13. Lymphknotenmetastasen werden derzeit diagnostiziert, indem das Lymphgewebe, das über die wichtigsten Blutgefäße im Becken und Bauch liegt, operativ entfernt wird. Dieses Verfahren, bekannt als Lymphadenektomie, ist aufgrund widersprüchlicher Überlebensdaten aus zwei großen Studien14,15,16,17,18 und der bekannten Risiko einer intraoperativen15,19,20 und postoperativen Morbidität21,22,23. Da die aktuellen nicht-invasiven bildgebenden Modalitäten nicht über die erforderliche Empfindlichkeit und Spezifität verfügen, um lymphknotendissektion24zu ersetzen, wurde versucht, neue diagnostische Bildgebungstechniken zu entwickeln. Um diese neuartigen Techniken in einem präklinischen Umfeld zu testen, ist ein zuverlässiges Modell von Endometriumkrebs mit retroperitonealen Lymphknotenmetastasen erforderlich.
Das Kaninchen VX2 Tumormodell ist ein etabliertes Modell, das ausgiebig verwendet wurde, um mehrere menschliche solide Organtumoren25 einschließlich Lunge26, Kopf und Hals27,28, Leber29, Niere30, Knochen31,32, Gehirn33, Bauchspeicheldrüse34 und Gebärmutter35,36,37. Das VX2-Modell wurde ursprünglich 1940 von Kidd und Rous38 durch die erfolgreiche Transplantation eines Baumwollschwanz-Kaninchen-Papilloma-Virus von Shope im Jahr 1933entdeckt 39entwickelt. Seit dieser Zeit wurde das VX2-Modell in vivo beibehalten, was eine serielle Passage im Quadrizeps-Muskel von White New Zealand Kaninchen40erfordert. In jüngerer Zeit jedoch haben mehrere Gruppen erfolgreich VX2-Zellen in vitro40,41,42 angebaut und die zurückgehaltene Tumorigenität der kultivierten Zelllinie31 , 42,43. VX2-Tumoren sind histologisch als anaplastische Plattenepithelkarzinome44 definiert und enthalten Drüsenmerkmale, die dem Adenokarzinom26ähneln. Tumore zeichnen sich durch einfache Implantation, schnelles Wachstum und Hypervaskularität44,45 und zuverlässig metastasieren, am häufigsten auf regionale und entfernte Lymphknoten45. Ähnlichkeiten in der Gefäß- und Lymphanatomie46 sowie der orthotopischen Wachstumsstelle stellen sicher, dass das metastasierende Muster des Kaninchens VX2-Karzinom dem des menschlichen Endometriumkrebses nachahmt, was das VX2-Modell zu einem zuverlässigen Modell für die Untersuchung menschlicher metastasierende Erkrankung. Darüber hinaus deuten histologische Merkmale wie abnorme mikrovaskuläre Proliferation47 sowie immunologische48 und genetische Ähnlichkeiten49,50 zwischen Mensch und Kaninchen darauf hin, dass der Tumor Mikroumgebung kann die des menschlichen Endometriumkrebses widerspiegeln.
Mehrere Gruppen haben über die Verwendung von VX2 berichtet, um ein Modell von Endometriumkrebs mit retroperitonealen Metastasen mit einer hohen gemeldeten Erfolgsrate36,51,52zu erstellen; In der aktuellen Literatur bestehen jedoch erhebliche Unterschiede hinsichtlich der Methode der Modellerstellung. Zellsuspensionsdosen so niedrig wie 4 x 105 Zellen/Gebärmutterhorn51 und so hoch wie 5 x 109 Zellen/Uterushorn37,53 wurden ohne Standardkonsens über die erforderliche VX2 Zelldosis berichtet. Außerdem wurden eine Vielzahl von Impfmethoden berichtet, einschließlich mikrochirurgischer Implantation von Tumoren in das Uterusmyometrium36, Injektion von VX2-Zellsuspension37,44,52 , 53 und in einigen Fällen die Zugabe von Uterushorn-Nähte vor der Innokulation52. Schließlich haben keine Gruppen die Verwendung von kultivierten VX2-Zellen gemeldet, um dieses Modell zu erstellen. Der Zweck dieser Studie besteht also darin, eine erfolgreiche standardisierte Methode der VX2-Modellerstellung zu demonstrieren und die erste Verwendung kultivierter VX2-Zellen zu melden, um ein Modell von Endometriumkrebs mit retroperitonealen Metastasen bei einem Kaninchen zu erstellen.
Hierin haben wir über eine standardisierte chirurgische Methode zur Etablierung eines VX2-Endometriumkrebsmodells berichtet und über die erste Verwendung kultivierter VX2-Zellen berichtet, um dieses Modell zu erstellen. Die Tumoraufnahmerate von 75% ist niedriger als die 100% Prozent Rate zuvor in der Literatur berichtet35,37,53,56; jedoch ist die Rate der pathologisch bestätigten Lymphknote…
The authors have nothing to disclose.
Diese Studie wurde vom Terry Fox Research Institute (PPG-1075), dem Canadian Institute of Health Research (Foundation Grant #154326), dem Canadian Cancer Society Research Institute (704718), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, Stiftung für Innovation und Prinzessin Margaret Cancer Foundation.
Ich möchte Dr. Marguerite Akens für die Bereitstellung der ersten VX2-Zellen für die Etablierung des ursprünglichen VX2-Modells und der gefrorenen VX2-Tumorblöcke danken. Ich möchte Marco DiGrappa für die Unterstützung bei der Durchführung erster VX2-Zellkulturexperimente und Lili Ding für die Unterstützung bei der VX2-Zellkultur danken.
11-blade scalpel, Sterile, Disposible | Aspen Surgical (VWR) | 80094-086 | |
22-gague ear vein catheter | CDMV | 14332 | |
3-0 absorbable poly-filament suture (Polysorb) | Covidien | 356718 | |
3-0 braided absorbable suture (Polysorb) | Covidien | 356718 | |
70uM cell strainer, Individually wrapped, Nylon | Falcon | 352350 | |
Acepromazine (Atravet) | CDMV | 1047 | |
Betadine soap (Poviodone iodine 7.5%) | CDMV | 4363 | |
Betadine solution (Poviodone iodine 10%) | UHN Stores | 457955 | |
Buprenorphine | McGill University | ||
Cefazolin | UHN in-patient pharmacy | No Cat # Needed | |
Chlorhexidine solution | CDMV | 119872 | |
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 100mm dishes | Corning | 354450 | brand not important |
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 24-well plates | Corning | 354408 | brand not important |
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 6-well plates | Corning | 354400 | brand not important |
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, *LDEV-free, 10 mL | Corning | 354234 | |
DMEM/HAM F12 1:1 | Life Technologies | 11320 | brand not important |
DMSO | Caledon Lab Chem | 1/10/4100 | |
Enrofloxacin (Baytril injectable) | CDMV | 11242 | |
Falcon Tube | Corning Centri-Star | 430828 | |
Fetal Bovine Serum, Qualified, Canadian Origin, 500ml | Life Technologies | 12483020 | brand/source not important |
Isoflurane | UHN in-patient pharmacy | No Cat # Needed | |
Isohexol contrast | GE Healthcare | 407141210 | |
Meloxicam (Metacam 0.5%) | CDMV | 104674 | |
Normal Saline | House Brand (UofT Medstore) | 1011 | |
PBS | Multicell or Sigma | 331-010-CL or D8537-500mL | |
Penicillin/Streptomycin (100mL; 10000U Penicillin, 10000ug Streptomycin) | Corning-Cellgro | CA45000-652 | |
Sterile Hanks Balanced Salt Solution (-Ca++, -Mg++, -Phenol Red) | T.C.M.F (Dr Bristow) | 28-Jan-11 | |
Surgical Glue (Tissue Adhesive) | 3M Vetbond | 14695B | |
Trypsin (0.25%), Proteomics Grade | Sigma | T-6567-5X20UG | |
Trypsin-EDTA, 0.05%, 100ml | Wisent Inc | 325-542-EL | brand not important |