En ortotopisk endometriecancer modell med retroperitoneal lymfadenopati tillverkad av in vivo propagerade och odlade VX2 celler

Summary

Detta protokoll presenterar en standardiserad metod för att odla VX2 celler i kulturen och att skapa ett ortoämne VX2 modell av endometriecancer med retroperitoneal lymfkörtel metastaser i kaniner. Ortoämnet endometriecancer modeller är viktiga för den prekliniska studien av nya Imaging modaliteter för diagnos av lymfkörteln metastaser.

Abstract

Endometriecancer är den vanligaste gynekologiska malignitet i Nordamerika och incidensen stiger över hela världen. Behandling består av kirurgi med eller utan adjuvant terapi beroende på lymfkörtelengagemang som bestäms av lymfadenektomi. Lymfadenektomi är ett Morbid förfarande, som inte har visat sig ha en terapeutisk nytta hos många patienter, och därmed en ny metod för att diagnostisera lymfkörtel metastaser krävs. För att testa nya avbildnings agenter behövs en tillförlitlig modell av endometriecancer med retroperitoneala lymfnodmetastaser. Den VX2 endometriecancer modellen har beskrivits ofta i litteraturen; Det finns dock en betydande variation när det gäller metoden för modell etablering. Dessutom har inga studier rapporterat om användningen av odlade VX2 celler för att skapa denna modell eftersom endast celler som sprids in vivo tidigare har använts. Häri presenterar vi en standardiserad kirurgisk metod och postoperativ övervakningsmetod för inrättandet av VX2 endometriecancer modellen och rapportera om den första användningen av odlade VX2 celler för att skapa denna modell.

Introduction

Endometriecancer, eller cancer i livmoderslemhinnan, är den näst vanligaste gynekologiska malignitet i världen och den vanligaste malignitet i utvecklade nationer¹. Incidensen av endometriecancer har stadigt ökat, ökar med 2,3% per år mellan 2005-2013 med en motsvarande 2,2% ökning av dödlighet^1,2,3. Diagnosen lymfkörteln metastaser är av största vikt eftersom närvaron av positiva lymfkörtlar är en stark negativ prediktor för överlevnad^4,5,6,7 och kan vägleda administrationen av adjuvant terapi^{8,9,10,11,12,13}. Lymfkörtel metastaser diagnostiseras för närvarande genom kirurgiskt avlägsnande av lymfvävnaden överliggande de stora blodkärlen i bäckenet och buken. Detta förfarande, känd som en lymfadenektomi, är kontroversiellt på grund av motstridiga överlevnadsdata från två stora prövningar^{14,15,16,17,18} och den kända risk för intraoperativ^15,19,20 och postoperativ morbiditet^21,22,23. Eftersom nuvarande icke-invasiva avbildning modaliteter inte har erforderlig känslighet och specificitet för att ersätta lymfkörtel dissektion²⁴, det har varit en push att utveckla nya diagnostiska Imaging tekniker. För att testa dessa nya tekniker i en preklinisk miljö krävs en tillförlitlig modell av endometriecancer med retroperitoneal lymfnodmetastaser.

Den kanin VX2 tumör modell är en väletablerad modell som har använts i stor utsträckning för att studera flera humana solida organ^{tumörer 25} inklusive lung²⁶, huvud och hals^27,28, lever²⁹, njure³⁰, Ben^31,32, Brain³³, bukspottkörteln³⁴ och livmodern^35,36,37. Den VX2 modellen utvecklades ursprungligen i 1940 av Kidd och Rous³⁸ genom att framgångsrikt transplanterade en cottontail kanin papillomvirus upptäcktes av shope i 1933³⁹. Sedan dess, den VX2 modellen har bibehållits in vivo, vilket kräver seriell passage i quadriceps muskeln av vita nya Zeeland kaniner⁴⁰. På senare tid har dock flera grupper framgångsrikt vuxit VX2 celler in vitro^40,41,42 och visat den balanserade tumorigenecity av den odlade cell linjen^{31, 42,43}. VX2 tumörer är histologiskt definieras som anaplastiskt skivepitelcancer cell karcinom⁴⁴ och innehåller körtelfunktioner som liknar adenocarcinom²⁶. Tumörer kännetecknas av enkel implantation, snabb tillväxt och Hyper-vascularity^44,45 och tillförlitligt metastasize, oftast till regionala och avlägsna lymfkörtlar⁴⁵. Likheter i livmoder vaskulär och lymfatiska anatomi⁴⁶ samt ortotopisk tillväxt webbplats se till att metastaserande mönster av kanin VX2 carcinoma härmar den av mänskliga endometriecancer, vilket gör VX2 modellen en tillförlitlig modell för att studera mänskliga metastaserande sjukdom. Dessutom, histologiska funktioner såsom onormal mikrovaskulär proliferation⁴⁷ , samt immunologiska⁴⁸ och genetiska likheter^49,50 mellan människor och kaniner tyder på att tumören mikromiljö kan återspegla den mänskliga endometriecancer.

Flera grupper har rapporterat om användningen av VX2 att skapa en modell av endometriecancer med retroperitoneala metastaser med en hög rapporterade andelen framgångsrika^36,51,52; Det finns dock en betydande variation inom den aktuella litteraturen med hänsyn till metoden för att skapa modeller. Cell suspension doser så låga som 4 x^{10 5} celler/livmoder^{horn 51} och så hög som 5 x 10⁹ celler/livmoder horn^37,53 har rapporterats utan standard konsensus om den erforderliga VX2 cellulära dosen. Samt, en mängd olika inokuleringsmetoder har rapporterats inklusive mikro-kirurgisk implantation av tumör i livmodern myometrium³⁶, injektion av VX2 cellsuspension^{37,44,52 , 53} och i vissa fall, tillsats av livmoder horn suturering före innoympning⁵². Slutligen har inga grupper rapporterat användningen av odlade VX2 celler för att skapa denna modell. Sålunda, syftet med denna studie är att demonstrera en framgångsrik standardiserad metod för VX2 modellskapande och att rapportera den första användningen av odlade VX2 celler för att skapa en modell av endometriecancer med retroperitoneala metastaser i en kanin.

Protocol

Djupa bukväggen stängning: identifiera spetsen av peritonealsnitt och ta tag i peritoneum, rectus muskler och fascia med vävnad forceps. Alla djurstudier utfördes i Animal Resource Center (ARC) godkända anläggningar i universitetets hälso-och sjukvårds nät och i enlighet med godkända djur användnings-och vårdprotokoll (AUP #3994/#4299). VX2 cell line erhölls från Dr Aken ‘ s Lab på University Health Network. 1. skapandet av in vitro-VX2 cellinjer Skörda VX2 tumören f…

Representative Results

Tjugoåtta kaniner användes för att skapa endometriecancer modellen. Kaniner hade en genomsnittlig vikt på 2,83 kg (2,71-3.58 kg) vid tidpunkten för experimentet. Livmodertumörer växte framgångsrikt i 21 kaniner för en övergripande modell framgång på 75%. Innan införandet av livmodern suturering i protokollet, var andelen framgångsrika 57% jämfört med 81% efter livmoder suturering lades. Livmoder suturering lades till protokollet efter den 7: e kanin som svar på…

Discussion

Häri har vi rapporterat en standardiserad kirurgisk metod för inrättandet av en VX2 endometriecancer modell och rapporterade om den första användningen av odlade VX2 celler för att skapa denna modell. Tumören ta hastighet av 75% är lägre än 100% procentsatsen tidigare rapporterats i litteraturen^35,37,53,56; emellertid, THW 90% frekvens av patologiskt bekräftade lymfkörtel metastaser…

Materials

11-blade scalpel, Sterile, Disposible	Aspen Surgical (VWR)	80094-086
22-gague ear vein catheter	CDMV	14332
3-0 absorbable poly-filament suture (Polysorb)	Covidien	356718
3-0 braided absorbable suture (Polysorb)	Covidien	356718
70uM cell strainer, Individually wrapped, Nylon	Falcon	352350
Acepromazine (Atravet)	CDMV	1047
Betadine soap (Poviodone iodine 7.5%)	CDMV	4363
Betadine solution (Poviodone iodine 10%)	UHN Stores	457955
Buprenorphine	McGill University
Cefazolin	UHN in-patient pharmacy	No Cat # Needed
Chlorhexidine solution	CDMV	119872
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 100mm dishes	Corning	354450	brand not important
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 24-well plates	Corning	354408	brand not important
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 6-well plates	Corning	354400	brand not important
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, *LDEV-free, 10 mL	Corning	354234
DMEM/HAM F12 1:1	Life Technologies	11320	brand not important
DMSO	Caledon Lab Chem	1/10/4100
Enrofloxacin (Baytril injectable)	CDMV	11242
Falcon Tube	Corning Centri-Star	430828
Fetal Bovine Serum, Qualified, Canadian Origin, 500ml	Life Technologies	12483020	brand/source not important
Isoflurane	UHN in-patient pharmacy	No Cat # Needed
Isohexol contrast	GE Healthcare	407141210
Meloxicam (Metacam 0.5%)	CDMV	104674
Normal Saline	House Brand (UofT Medstore)	1011
PBS	Multicell or Sigma	331-010-CL or D8537-500mL
Penicillin/Streptomycin (100mL; 10000U Penicillin, 10000ug Streptomycin)	Corning-Cellgro	CA45000-652
Sterile Hanks Balanced Salt Solution (-Ca++, -Mg++, -Phenol Red)	T.C.M.F (Dr Bristow)	28-Jan-11
Surgical Glue (Tissue Adhesive)	3M Vetbond	14695B
Trypsin (0.25%), Proteomics Grade	Sigma	T-6567-5X20UG
Trypsin-EDTA, 0.05%, 100ml	Wisent Inc	325-542-EL	brand not important