यह प्रोटोकॉल विशिष्ट कोशिका आबादी में सटीक सहस्थानीकरण विश्लेषण को सक्षम करने के प्रारंभिक चरण ज़ेब्राफ़िश भ्रूण से क्रायोसेक्शन पर अनुक्रमिक इम्यूनोफ्लोरेसी और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री को दर्शाता है।
intercellular बातचीत की जांच अक्सर विशिष्ट सेल आबादी और सटीक प्रोटीन स्थानीयकरण के असतत लेबलिंग की आवश्यकता है. जेब्राफ़िश भ्रूण एक में विवो मॉडल के साथ इस तरह की बातचीत की जांच के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण है। प्रोटीन अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए पूरे-माउंट इम्यूनोहिस्टोकेमिकल और इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख अक्सर जेब्राफ़िश भ्रूण में लागू किए जाते हैं। हालांकि, तीन आयामी अंतरिक्ष में सह-स्थानीयकृत प्रोटीन की सटीक मानचित्रण प्राप्त करना मुश्किल हो सकता है। इसके अलावा, कुछ अध्ययनों में दो एंटीबॉडी के उपयोग की आवश्यकता हो सकती है जो एक ही तकनीक के साथ संगत नहीं हैं (उदाहरण के लिए, एंटीबॉडी 1 इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए ही उपयुक्त है और एंटीबॉडी 2 इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए ही उपयुक्त है)। यहाँ वर्णित विधि का उद्देश्य प्रारंभिक चरण जेब्राफ़िश भ्रूण से व्युत्पन्न व्यक्तिगत क्रायोसेक्शन पर अनुक्रमिक इम्यूनोफ्लोरेसेंस और/या इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री करना है। यहाँ हम एक एकल सेल स्तर पर प्रोटीन अभिव्यक्ति की सटीक पहचान प्राप्त करने के क्रम में एक ही क्रायोसेक्शन के लिए इमेजिंग इम्यूनोफ्लोरेसी, इमेजिंग, इम्यूनोफ्लोरेसीकेमिया के अनुक्रमिक दौर के उपयोग का वर्णन करते हैं। इस पद्धति के प्रारंभिक चरण ज़ेब्राफ़िश भ्रूण है कि व्यक्तिगत कोशिकाओं में कई प्रोटीन लक्ष्यों की सही पहचान की आवश्यकता में किसी भी अध्ययन के लिए उपयुक्त है.
जेब्राफ़िश एक अत्यंत मजबूत मॉडल जीव है कि वर्तमान में जैव चिकित्सा अनुसंधान में विषयों की एक विस्तृत विविधता भर में प्रयोग किया जाता है. विशेष रूप से, तेजी से बाहरी विकास और ज़ेब्राफ़िश भ्रूण के translucency विवो अध्ययन में के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण प्रदान करते हैं. इसमें, हम अनुक्रमिक इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल (आईएचसी) के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं, क्रायोसेक्शन्ड जेब्राफ़िश भ्रूणों का विश्लेषण करते हैं। इस उपन्यास प्रक्रिया एक ही स्लाइड पर दो एंटीबॉडी के अनुक्रमिक आवेदन का उपयोग करता है, सेलुलर स्तर पर colocalized प्रोटीन की सही पहचान को सक्षम करने, जबकि ऊतक वर्गों के संरक्षण. इस प्रोटोकॉल ज़ेबराफ़िश मॉडल के साथ अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयोगी है, एंटीबॉडी की एक अपेक्षाकृत छोटी संख्या के बाद से माउस मॉडल की तुलना में ज़ेब्राफ़िश में IF और /
intercellular बातचीत के अवलोकन के कई अध्ययनों में एक आवश्यक तत्व है, और आणविक तंत्र सेलुलर स्तर पर काम कर रहा है कि जीव स्तर पर underlie phenotypes में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं. इसके अतिरिक्त, प्रोटीन अभिव्यक्ति सेलुलर समारोह के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं, खासकर जब सेल के भीतर एक साथ कई प्रोटीन की अभिव्यक्ति की जांच (सह स्थानीयकरण). हालांकि पूरे-माउंट आईएचसी और आईएफ का उपयोग आमतौर पर जेब्राफ़िश भ्रूणों में प्रोटीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए किया जाता है1,2,3,4,5, पूरे माउंट प्रक्रियाएं हो सकती हैं सटीक colocalization डेटा प्राप्त करने के लिए समस्याग्रस्त. हमारे अनुभव में, यह ऊतक की परतों के बीच अंतर और पूरे-माउंट नमूनों में एकल सेल स्तर पर प्रोटीन अभिव्यक्ति कल्पना करने के लिए मुश्किल हो सकता है। इमेजिंग सॉफ्टवेयर प्रोग्राम आम तौर पर सतह धुंधला बनाम गहरे धुंधला के बीच भेद करने में असमर्थ हो सकता है. गैर-सतहस्तर प्रोटीन अभिव्यक्ति अधिक चमकदार व्यक्त सतह स्तर अभिव्यक्ति द्वारा अस्पष्ट किया जा सकता है, परिमाणीकरण में inaccuracies के लिए अग्रणी. इसके अतिरिक्त, सबसे पारंपरिक ज़ेब्राफ़िश समाशोधन विधियों काफी विषाक्त कर रहे हैं6 और इस तरह कम उपयोग के लिए वांछनीय.
IF और IHC जैसे एंटीबॉडी-आधारित तकनीकों का उपयोग अक्सर अनुभागीय सामग्री में प्रोटीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए किया जाता है, जो जटिल ऊतकों के भीतर एक विशेष प्रोटीन व्यक्त करने वाली असतत कोशिका आबादी की पहचान को सरल बनाते हैं। IHC आमतौर पर colocalization के लिए प्रयोग किया जाता है, सबसे अधिक बार विभिन्न मेजबान प्रजातियों में संयुग्मी दो अलग एंटीबॉडी का उपयोग करके और अलग अलग रंग क्रोमोजेन4,7,8,9के साथ कल्पना , 10. हालांकि, कई क्रोमोजेन का उपयोग करने से गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि धुंधला या रंग11,12की असंगति हो सकती है।
हमने क्रायोसेक्शन्ड प्रारंभिक चरण जेब्राफ़िश भ्रूणों पर अनुक्रमिक आईएफ और आईएचसी द्वारा अनेक प्रोटीनों का पता लगाने के लिए एक नया प्रोटोकॉल विकसित किया है। क्रायोसेक्शनिंग विशेष रूप से जेब्राफ़िश भ्रूण जैसे नाजुक ऊतकों के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है, और क्रायोसेक्शन फ्लोरोसेंट आधारित परख13,14के लिए पैराफिन-एम्बेडेड वर्गों से बेहतर हैं। हम संयुक्त IF और IHC के बजाय दोहरे रंग IF या IHC का अनुकूलन करने के लिए चुना है, एक भी परख प्रकार के लिए एंटीबॉडी असंगति की समस्या को दरकिनार करने के लिए. इन समस्याओं को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी है कि ज़ेबराफ़िश में उपयोग के लिए मान्य कर रहे हैं की सीमित संख्या के कारण जेब्राफ़िश से जुड़े अनुसंधान के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक हैं. वास्तव में, चार बड़ी कंपनियों के एक अध्ययन से पता चला है कि माउस में उपयोग के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी के बारे में 112,000 बनाम के बारे में 5,300 ज़ेब्राफ़िश में उपयोग के लिए15था . अंत में, हम एक प्रोटोकॉल है कि एक ही cryosection पर किया जा सकता है विकसित करने के लिए चुना है, जो आवश्यक है जब छोटे या सीमित ऊतक के नमूने के साथ काम कर के रूप में इस तरह के जेब्राफ़िश भ्रूण से प्राप्त कर रहे हैं.
इस प्रोटोकॉल को 48 एच के बाद निषेचन चिमेरिक जेब्राफ़िश भ्रूणों में दाता कोशिकाओं के प्रोजीवनात्मक व्यवहार का आकलन करने के लिए डिजाइन किया गया था जो ब्लास्टुला-टू-ब्लास्टुला प्रत्यारोपण द्वारा उत्पन्न किए गए थे जैसा कि कार्मनी-रैमपे और मोन्स16द्वारा वर्णित किया गया था। दाता भ्रूण प्राप्तकर्ता भ्रूण में दाता कोशिकाओं के प्रत्यारोपण से पहले एक फ्लोरोसेंट लेबल डेक्सट्रान संयुग्मी के साथ एक सेल चरण में इंजेक्ट किया गया. हम सेर के लिए इम्यूनोफ्लोरेसिस का इस्तेमाल किया 10 फॉस्फोरीलेटिड हिस्टोन एच 3 (पीएच 3) के लिए बढ़ते कोशिकाओं का पता लगाने के लिए लेबल dextran के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा पीछा करने के लिए चिमेरिक ज़ेब्राफ़िश भ्रूण में दाता कोशिकाओं का पता लगाने के लिए. pH3 का अनुक्रमिक पता लगाने और एक ही cryosection के भीतर लेबल डेक्सट्रान हमें पहचान करने के लिए सक्षम बनाने और व्यक्तिगत कोशिकाओं है कि दोनों मार्करों व्यक्त की मात्रा.
cryosectioned ज़ेब्राफ़िश के लिए यह अनुक्रमिक IF/IHC प्रोटोकॉल जेब्राफ़िश शोधकर्ताओं के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करेगा जो प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए एक सहस्थानीकरण प्रोटोकॉल की इच्छा रखते हैं। समस्याओं है कि इस प्रोटोकॉल को संबोधित करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, जैसे छोटे ऊतक नमूनों और सीमित एंटीबॉडी उपलब्धता, ज़ेब्राफ़िश मॉडल के लिए अद्वितीय नहीं हैं. अतः यह विधि अनुक्रमिक आईएफ/आईएचसी करने के इच्छुक किसी भी शोधकर्ता के लिए उपयोगी हो सकती है।
एथेंिक्स स्टेटमेंट:
सभी पशु अध्ययन संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति, उत्तरी कैरोलिना राज्य विश्वविद्यालय, Raleigh, उत्तरी केरोलिना, संयुक्त राज्य अमेरिका द्वारा अनुमोदित किया गया.
हम संयुक्त इम्यूनोफ्लोरेसींस और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए एक उपन्यास विधि प्रस्तुत किया है कि cryosectioned ज़ेब्राफ़िश भ्रूण पर colocalization प्रयोगों के प्रदर्शन में एक महत्वपूर्ण कदम आगे का प्रतिनिधित्व करता है. मौजूदा सहस्थानीकरण प्रोटोकॉल की कमी है , जिन्हें छोटे भ्रूणों और क्रायोसेक्शनेड सामग्री17,18के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित किया जाता है , जो कि अन्यथा आण्विक अध्ययन14 में प्रयोग किया जाता है . मौजूदा सहस्थानीकरण प्रोटोकॉल मुख्य रूप से दो फ्लोरोफोर्स17,18के एक साथ दृश्य पर ध्यान केंद्रित करते हैं . जबकि इन प्रोटोकॉल अच्छी तरह से काम कर सकते हैं, उनकी उपयोगिता एंटीबॉडी की उपलब्धता है कि (i) ज़ेब्राफ़िश में इस्तेमाल किया जा सकता है और (ii) IF के साथ संगत कर रहे हैं द्वारा सीमित है.
हमें लगता है कि जेब्राफ़िश भ्रूण के लिए cryosectioning का उपयोग संरक्षित ऊतक आकारिकी के मामले में एक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है. के रूप में IHC अधिक सामान्यतः cryosections7,8से पैराफिन वर्गों पर प्रदर्शन किया जाता है, प्रोटीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए cryosection आधारित IHC तरीकों के आगे अन्वेषण warranted है. पूरे माउंट IF का उपयोग ज़ेब्राफ़िश भ्रूण में अभिव्यक्ति के स्तर को विज़ुअलाइज़ करने के लिए एक आम विधि है, और अधिक सामान्यतः यदि क्रायोसेक्शन1,2,3,4, का उपयोग कर के बजाय साहित्य में वर्णित है, 19. हालांकि, पूरे माउंट प्रोटोकॉल की सीमाएं हैं, जिसमें गहरे ऊतकों में व्यक्त प्रोटीन के सटीक स्थानीयकरण की कमी और गहरे ऊतकों में प्रोटीन अभिव्यक्ति को अस्पष्ट करने के लिए सतह स्तर की अभिव्यक्ति की क्षमता शामिल है। हम लगातार cryopservation के बाद सेलुलर आकारिकी के उत्कृष्ट रखरखाव मनाया है, अनुभागीकरण, और अनुक्रमिक IF और IHC. अनुप्रयोगों है कि एकल सेल स्तर पर प्रोटीन अभिव्यक्ति के सटीक स्थानीयकरण की आवश्यकता के लिए, वहाँ अनुभाग आधारित प्रक्रियाओं के लिए एक महत्वपूर्ण लाभ के रूप में हम इस प्रोटोकॉल में वर्णित है. राल embedding प्रारंभिक चरण ज़ेब्राफ़िश भ्रूण20से वर्गों पर IF या IHC assays प्रदर्शन के लिए एक वैकल्पिक विकल्प प्रदान करता है. राल वर्गों cryosections की तुलना में ऊतक आकृति विज्ञान के बेहतर संरक्षण प्रदान करते हैं, और अपेक्षाकृत पतली ऊतक वर्गों तैयार किया जा सकता है. हालांकि, निर्माताओं आम तौर पर इम्यूनो आधारित परख के लिए राल वर्गों के उपयोग की सिफारिश नहीं है, के रूप में रेजिन के कुछ घटकों वर्गों से हटाया नहीं जा सकता है और एंटीबॉडी बाध्यकारी साइटों मुखौटा हो सकता है21.
जबकि प्रोटोकॉल के पूरे अभिव्यक्ति पैटर्न का सटीक और सफल विश्लेषण के लिए आवश्यक है, कुछ विशिष्ट कदम प्रयोगात्मक सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं. पहला महत्वपूर्ण कदम ओटी13,14में एम्बेडिंग के दौरान भ्रूणों की हैंडलिंग है . यह एक ही अनुप्रस्थ विमान में प्रत्येक भ्रूण उन्मुख करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है ताकि वर्गों सभी भ्रूण के लिए लगभग एक ही क्षेत्र से काट रहे हैं. हमने पाया है कि छोटे गेज सुइयों का उपयोग करने के लिए छोटे, भ्रूण अभिविन्यास के लिए चिपचिपा OCT माध्यम के माध्यम से जानबूझकर आंदोलनों forceps, जो बहुत बड़े हैं और बहुत ज्यादा OCT माध्यम विस्थापित का उपयोग करने के लिए बेहतर है. एक दूसरा महत्वपूर्ण कदम जमे हुए ब्लॉक के अनुभागीकरण के दौरान होता है, क्योंकि यह महत्वपूर्ण प्रशिक्षण और अनुभव के बिना वांछित ऊतक (ओं) होते हैं कि उच्च गुणवत्ता वाले वर्गों को प्राप्त करने के लिए मुश्किल हो सकता है। हम इस प्रकार परीक्षण के नमूने के उपयोग की सिफारिश जब तक तकनीक में महारत हासिल है. एक तीसरा महत्वपूर्ण कदम कवरस्लिप हटाने है, जिसमें ऊतक के नमूनों को परेशान करने या पट्टी करने की क्षमता है। हमने पाया है कि पीबीएस कंटेनर से स्लाइड की कवरस्लिप और धीमी गति से हटाने को ढीला करने के लिए कोमल आंदोलन का एक संयोजन कवरलिप्स को हटाने के लिए सबसे प्रभावी तरीका है। एक कोमल और स्थिर हाथ सबसे अच्छा है; शोधकर्ताओं ने पाया जा सकता है कि कुछ परीक्षण और त्रुटि coverss को प्रभावी ढंग से दूर करने के लिए सीखने के लिए आवश्यक है.
प्रोटोकॉल में अतिरिक्त महत्वपूर्ण कदम एंटीबॉडी अनुकूलन (प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी दोनों IF और IHC परख के लिए) और क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट और counterstain के लिए स्लाइड के जोखिम शामिल हैं. प्राथमिक एंटीबॉडी विशिष्टता और लक्ष्य एकाग्रता के बारे में पूरी तरह से अनुसंधान आवश्यक है; आम तौर पर, यह IF/IHC संयोजन शुरू करने से पहले प्राथमिक एंटीबॉडी सांद्रता का अनुकूलन करने के लिए किया जाएगा कि IF और IHC के लिए कम से कम दो अलग-अलग प्रयोगों के लिए पर्याप्त गैर कीमती नमूने इकट्ठा करने के लिए सबसे अच्छा है। प्रत्येक प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए एक ज्ञात सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण सहित प्रत्येक प्रयोग में आवश्यक है सुनिश्चित करने के लिए कि दोनों आईएफ और IHC assays उचित प्रदर्शन कर रहे हैं. माध्यमिक एंटीबॉडी एकाग्रता के लिए समायोजन भी आवश्यक हो सकता है. IHC परख के लिए क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट और counterstain करने के लिए ऊतक वर्गों के जोखिम के अनुकूलन की आवश्यकता है, के बाद से निर्माता दिशा निर्देशों अक्सर संभव जोखिम समय की एक विस्तृत श्रृंखला का वर्णन. नहीं सभी क्रोमोजन counterstains और अंतर्जात ऊतक pigmentation के साथ संगत हो सकता है, क्रोमोजन चयन के संबंध में सावधान योजना की आवश्यकता होती है.
वहाँ कई संभावित संशोधन है कि वर्णित प्रोटोकॉल के लिए लागू किया जा सकता है, और हम सफलतापूर्वक एंटीबॉडी के अन्य संयोजन है कि दोनों IF के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है के साथ इस प्रोटोकॉल प्रदर्शन किया है. जैसा कि ऊपर बताया गया है, क्रोमोजेनिक पदार्थों में विशिष्ट प्रतिपक्षों के साथ अलग-अलग संगतता होती है। हमने पाया है कि इन घटकों प्रोटोकॉल में आसानी से संशोधन कर रहे हैं। इसके अतिरिक्त, एंटीबॉडी ऊष्मायन के लिए पैरामीटर काफी लचीला कर रहे हैं, और वृद्धि या वांछित धुंधला तीव्रता के आधार पर कम किया जा सकता है. एम्बेडिंग प्रक्रिया भी संशोधित किया जा सकता है। जबकि हम अनुप्रस्थ वर्गों पर ध्यान केंद्रित किया है, भ्रूण आसानी से ब्याज की विशेष ऊतकों को संबोधित करने के लिए किसी भी दिशा में उन्मुख किया जा सकता है. अंत में, इस प्रोटोकॉल में एक से अधिक संभव विराम बिंदु हैं। निर्जलित भ्रूण कुछ महीनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर 100% MeOH में संग्रहीत किया जा सकता है; जमे हुए ब्लॉक अप करने के लिए तीन महीने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है; और तैयार स्लाइड एक स्लाइड बॉक्स में नौ महीने तक के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
इस संयुक्त IF/IHC प्रोटोकॉल की सापेक्ष जटिलता के कारण, भिन्नता या त्रुटि के कई संभावित स्रोत हैं जिन्हें समस्या निवारण की आवश्यकता हो सकती है, ऊतक गुणवत्ता से शोधकर्ता अनुभव से नमूना हैंडलिंग तक। ऊपर वर्णित अधिकांश महत्वपूर्ण कदम महत्वपूर्ण माने जाते हैं क्योंकि उन्हें या तो व्यक्तिगत उपयोगकर्ता स्तर पर ऑप्टिमाइज़ेशन की आवश्यकता होती है या उन्हें विशेष निपुणता, कौशल और अनुभव की आवश्यकता होती है. हालांकि, हमने पाया है कि nonspecific पृष्ठभूमि धुंधला और कम संकेत तीव्रता अनुकूलन की आवश्यकता सबसे महत्वपूर्ण मुद्दों रहे हैं. किसी भी IF या IHC प्रोटोकॉल के साथ के रूप में, इन मुद्दों को संबोधित समय लगता है और श्रम गहन हो सकता है, और इस विधि के साथ संयुक्त किया जा सकता है के बाद से दो तकनीकों संयुक्त कर रहे हैं. इस कारण से, हम अत्यधिक IF और IHC अलग से संयुक्त प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ने से पहले अनुकूलन की सलाह देते हैं.
हालांकि हम भविष्यवाणी करते हैं कि यह विधि प्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयोगी होगी, फिर भी संभावित सीमाएँ हैं. इस प्रक्रिया के सफल प्रदर्शन कई धोने कदम शामिल है कि दो अनुक्रमिक प्रयोगों के माध्यम से बरकरार ऊतक के नमूने को बनाए रखने पर निर्भर है. इस कारण से, अनुभागिंग या ऊतक हैंडलिंग के दौरान उत्पन्न होने वाली कोई भी समस्या, जिसमें गुणवत्ता में निम्नीकृत हो सकने वाली पुरानी स्लाइड्स का उपयोग शामिल है, शोधकर्ताओं की इस प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक करने की क्षमता को सीमित कर देगा. हालांकि स्लाइड संभावित रूप से नौ महीने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, स्लाइड के ऊतक पालन समय के साथ गिरावट आती है और हम स्लाइड है कि तैयारी या आदर्श के एक महीने के भीतर उपयोग किया जाता है के साथ सबसे अच्छी सफलता थी, अगले दिन. एक दूसरी सीमा ज़ेब्राफ़िश भ्रूण के छोटे पदचिह्न है. जबकि हमने पाया है कि इस प्रयोग को प्रोटीन है कि अपेक्षाकृत प्रचुर मात्रा में प्रारंभिक चरण भ्रूण में व्यक्त कर रहे हैं visualizing में उपयोगी हो, प्रोटीन है कि असंगत या निम्न स्तर पर व्यक्त कर रहे हैं बहुत मुश्किल हो सकता है एक खंड में कब्जा. अंत में, के बाद से प्रोटोकॉल का उपयोग करता है 10-u201212 $m cryosections, यह सबसे अच्छा बड़े संरचनाओं में प्रोटीन अभिव्यक्ति के मूल्यांकन के लिए उपयुक्त है, जैसे नाभिक के रूप में, बजाय छोटे उप-कोशिकीय घटकों.
संक्षेप में, हमारे संयुक्त IF/IHC प्रोटोकॉल प्रारंभिक चरण ज़ेब्राफ़िश भ्रूण में अध्ययन की एक विस्तृत विविधता के लिए फायदेमंद होगा, और ऐसे नमूनों में सटीक प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण में एक महत्वपूर्ण नवाचार का प्रतिनिधित्व करता है. हमारी विधि, चित्रा 5में सफलतापूर्वक दिखाया गया है, शोधकर्ताओं को क्रायोसेक्शन में प्रारंभिक चरण ज़ेब्राफ़िश भ्रूण के नाजुक आकारिकी को संरक्षित करने की अनुमति देगा, जबकि वर्तमान में उपलब्ध प्राथमिक एंटीबॉडी की कुछ सीमित सीमा के साथ काम कर रहे हैं इस प्रजाति में IF या IHC में उपयोग के लिए मान्य. इस प्रोटोकॉल की संभावना अन्य मछली और उभयचर प्रजातियों में अध्ययन के लिए उपयोगी हो जाएगा (जैसे, Medaka और Xenopus spp.), जो एंटीबॉडी उपलब्धता के लिए इसी तरह की सीमाओं से बाधित कर रहे हैं, और पारंपरिक स्तनधारी मॉडल के लिए लागू हो सकता है के रूप में अच्छा.
The authors have nothing to disclose.
इस कार्य को NIH अनुदान 5K01OD021419-02 और नेकां राज्य पशु चिकित्सा विश्वविद्यालय कॉलेज द्वारा समर्थित किया गया था.
15/25 | N/A | N/A | 15% fish gelatin/25% sucrose w/v, made in dH2O |
Alexa 555 secondary antibody | Invitrogen | A21429 | used at 1:2000 dilution in block buffer for IF |
Antibody Diluent | Dako | S3022 | |
Background Buster | Innovex | NB306 | |
block buffer (IF) | N/A | N/A | 5% normal goat serum, 0.1% Triton X-100 in 1X PBS |
cellSens imaging software | Olympus | cellSens | imaging software used with compound light microscope |
chimeric zebrafish embryos | N/A | N/A | AB wild-type chimera zebrafish embryos analyzed at 48 hpf |
Compound light microscope | Olympus | BX51 | used with digital camera and cellSens imaging software for image capture after IHC |
Confocal fluorescence microscope | Leica | DM 2500 | used with digital camera and Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software for image capture after IF |
disposable plastic molds, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Ted Pella | 27147-2 | |
Digital camera, light microscope | Olympus | DP27 | |
Digital camera, fluorescence microscope | Leica | TCS SPE | |
Ethanol | Koptec | V1001 | |
fish gelatin | Sigma | G7041 | |
Glass slides | Fisher | 12-550-15 | |
Hydrogen peroxide, 30% | Fisher | H325-100 | |
ImmPRESS HRP Polymer detection kit | Vector | MP-7401 | anti-rabbit secondary antibody, HRP polymer |
Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software | Leica | LAS AF 2.3.6 | imaging software used with confocal fluorescence microscope |
Methanol | Fisher | A452-4 | |
Modified Meyer's Hematoxylin | Thermo | 72804 | |
Normal Goat Serum | MP Biomedical | 191356 | |
OCT medium | Tissue-Tek/Fisher | 4583/4585 | |
anti-Oregon Green antibody | Molecular Probes/Life Technologies | A889 | used at 1:7500 dilution for IHC |
Oregon Green Dextran | Invitrogen | P7171 | used at 2.5% in 0.2M KCl |
Paraformaldehyde, 4% | Acros Organics | 416780030 | made in lab in 1x PBS |
Permount | Fisher | SP15 | |
1X phosphate-buffered saline | made in lab | N/A | 50 mL 10x PBS, up to 500 mL volume with dH2O |
10X phoshpate-buffered saline | made in lab | N/A | use Cold Spring Harbor protocol |
1X PBSt | made in lab | N/A | 50 mL 10x PBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O |
anti-Ser10 phosphorylated Histone H3 antibody | Santa Cruz | sc-8656-R | used at 1:500 dilution for IF |
Scott's Tap Water | Electron Microscopy Sciences | 26070-06 | have used other brands successfully in addition to EMS |
sucrose | Amresco | 335 | |
Tween-20 | Fisher | BP337 | |
TO-PRO3 | Invitrogen | T3605 | used at 1:1000 in 1x PBS for IF |
1X Tris-buffered saline | made in lab | N/A | 50 mL 10x TBS, up to 500 mL volume with dH2O |
10x Tris-buffered saline | made in lab | N/A | 85 g NaCl, 61 g Tris base, up to 1 L volume with dH2O |
1X TBSt | made in lab | N/A | 50 mL 10x TBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O |
Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
Vectashield | Vector | H-1000 | non-hardening mounting media |
Vector NovaRed substrate | Vector | SK-4800 | HRP substrate |
Xylene | Fisher | X3P-1GAL |