Här presenterar vi ett protokoll till kultur mänskliga enteroid eller colonoid enskiktslager som har intakt barriär-funktion att studera värd epitelial-bakterieflora interaktioner på cell- och biokemisk nivå.
Mänskliga 3-dimensionell (3D) enteroid eller colonoid kulturer härstammar från crypt bas stamceller är för närvarande den mest avancerade ex vivo -modellen av intestinal epitel. På grund av deras slutna strukturer och betydande stödjande extracellulärmatrix är 3D kulturer inte idealiska för värd-patogen studier. Enteroids eller colonoids kan odlas som epitelial enskiktslager på genomsläppliga vävnadsodling membran att möjliggöra manipulation av både luminala och basolateral cellytan och medföljande vätskor. Detta förbättrade luminala ytan hjälpmedel underlättar modellering bakteriell-host epitelial interaktioner såsom slem-nedbrytande förmåga av entrohemoragiska E. coli (EHEC) på colonic epitel. En metod för 3D kultur fragmentering, enskiktslager sådd och transepithelial elektriska motstånd (TER) mätningar att övervaka framstegen mot konfluens och differentiering beskrivs. Colonoid enskiktslager differentiering ger utsöndrade slem som kan studeras genom immunofluorescens eller immunoblotting tekniker. Mer allmänt, enteroid eller colonoid enskiktslager aktivera en fysiologiskt relevant plattform att utvärdera specifika cellpopulationer som kan riktas av patogena eller kommensaler bakterieflora.
Intestinal organoids, enteroids och colonoids har lett till många framsteg i förståelsen stamceller beteende, intestinal utveckling, barriär/transport funktion och celldifferentiering. 1 men 3D kultur begränsar studiet av värd epitelial-patogen interaktion eftersom lumen inte är direkt tillgängliga för bakterier eller virulens faktorer såvida de slutna strukturerna utsätts för Mikroskop. 2 , 3 utsöndras dessutom material såsom små molekyler, proteiner, eller slem inte kan provtas enkelt från 3D kultur för efterföljande analys. Effekterna av patogener på epiteliala barriären funktion4 och ion transport5 har utvärderats i 3D kultur med hjälp av fluorescerande färgämnen och time-lapse mikroskopi, men enskiktslager odlas på genomsläppliga vävnadsodling stöder är mottagliga för ytterligare tekniker såsom TER mätning och Ussing kammare/spänningen klämman inspelning. 6 , 7
Talrika publikationer har beskrivit protokoll för 2D eller enskiktslager kultur av enteroids/colonoids. Material som finns för att främja epitelial cell fastsättning inkluderar kollagen hydrogels,8,9 0,1% gelatin,10 tunt skikt murina sarkom-derived basalmembranet matrix (BMM),11,12, 13 och mänskligt kollagen IV. 6 , 7 , 14 , 15 , 16 , 17 Seeding metoder inkluderar mekanisk fragmentering genom pipettering6,14,15 eller dissociation av cell adhesion faktorer med hjälp av trypsin,10,11 dispase,13 eller EDTA. 9 några protokoll används icke-porös vävnadskultur plasticware för seedning, men detta begränsar basolateral tillgång, så de flesta program beror på genomsläppliga vävnadsodling skär. Dokumentation av stabil konfluenta enskiktslager bildandet och underhållet varierar kraftigt bland publikationerna. Dessutom tillväxt och differentiering media kompositioner för mänskliga kulturer skiljer sig åt mellan olika grupper och fortsätta att utvecklas när fler forskare anta och anpassa metoden för att passa deras ansökan och tillgängliga resurser.
För att hantera begränsningar i 3D intestinal epitelial kultur i värd-patogen interaktionsstudier, presenterar vi ett modifierat protokoll för att konvertera 3D mänskliga enteroids eller colonoids till en enskiktslager. Efter att uppnå konfluens i en krypta-liknande omogna tillstånd, leder tillbakadragande av tillväxtfaktorerna WNT3A, RSPO1 och hämmare A-83-01 och SB 202190 till differentiering representativa för små intestinal villus eller surface colonic epitel. Vi beskriva ideala matris, mänskligt kollagen typ IV, för att bestryka skären och skaffa enhetliga enteroid eller colonoid fragment för plätering. Vi visar att detta protokoll ger en konfluenta enskiktslager med hög likväl Colonoid enskiktslager utsöndrar ett tjockt apikala slem skikt, vilket möjliggör ex vivo studier av patogen-slem interaktion via immunoblotting eller immunfärgning. En modifierad fixering att bevara colonic slem lagret för immunfärgning också beskrivs. Denna metod syftar till att ge en lätthanterlig modell för att studera de tidigaste intestinal värd-patogen interaktionerna vid infektion.
Kritiska parametrar för framgångsrika bildandet av enteroid/colonoid enskiktslager inkluderar 1) friska, frodas 3D kulturer som utgångsmaterial; (2) beläggning infoga cellytan kultur med mänskligt kollagen IV före enskiktslager sådd; (3) fragmentering av 3D kulturer antingen mekaniskt eller enzymatiskt, men inte till den enda cell-nivån.
Under isolering av 3D enteroids/colonoids, kan optimal skakningar hastigheten variera beroende på en viss shaker modell roterande diameter. Avsikten är att inte bara skaka plattan för en effektiv blandning, men att också undvika stänk cellsuspension på omslagets plattan eller i närliggande brunnar. Inkubation perioder av < 30 min kan ge kvarstående BMM klängande cellerna, vilket kan hindra fastsättning och bildandet av enhetliga cell enskiktslager när pläterade på skären. Omfattande inkubation (≥ 1 h) kommer att ge signifikant minskade cellernas viabilitet.
Omfattningen av trituration krävs att sära på 3D enteroids/colonoids kan variera med kolv styvhet och användaren fingerfärdighet. Periodisk kontroll av väl innehållet på en ljus faskontrastmikroskop rekommenderas att bestämma fragment enhetlighet under sönderdelning, med ett mål av ungefärligt 30 celler per fragment. I stället för, eller utöver sönderdelning, kan suspensionen smältas kort med trypsin att erhålla mindre enhetlig fragment. Trypsin digest kan vara önskvärt om enskiktslager innehåller en stor andel av 3D-liknande strukturer bland en annars enda epitelskiktet. Dissociation att enstaka celler är dock inte önskvärt eftersom detta avsevärt minskar cellernas viabilitet. En väl av enteroids/colonoids odlade i en 35 μl BMM droplet kommer generellt att vara tillräckligt för att fylla 2-3 skär, men denna faktor kan variera beroende på antal och genomsnittliga storleken på de enteroids/colonoids.
Colonoid enskiktslager kan absorbera en betydande volym av apikala medium som de gör åtskillnad mellan. Detta kan kringgås genom att tillämpa ytterligare DM övre infoga kammaren (150-200 μl), trots delvis torkning av den övre kammaren inte verkar påverka negativt enskiktslager livskraft eller funktion i nedströms analyser. Efter cirka 4-5 dagar av differentiering utveckla colonoid enskiktslager extracellulära slem som kanske syns som tjock/geléartad material på cellytan efter noggrann aspiration av DM.
För EHEC växelverkan med lagrets yttre slem använder vi rutinmässigt bakteriell titer och inkubation perioden anges i protokollet. Unika bakteriestammar bör dock inledningsvis analyseras på flera koncentrationer och inkubation perioder att avgöra lämpliga parametrar för önskad effekt.
Under slem fixering, aspirera apikala medium kommer sannolikt ta bort de flesta av lagrets extracellulära okopplade slem. Det är därför viktigt att försiktigt hälla ut medlet. Om mediet behålls i Infoga av ytspänning, använda i hörnet av en vikta laboratorium vävnad att bryta ytspänningen och transportera bort de flesta av mediet. Efter fixering och färgning, kan slem lagret vara oavsiktligt rubbas eller tillplattad medan montering ett täckglas över filtret infoga. För att bevara slem höjd, placera filtret på en droppe montering media och försiktigt placera täckglas på filtret. Tryck på eller tryck ned täckglas som detta kan avsevärt förenkla slem lagret inte.
För att bilda en polariserad enskiktslager från celler i 3D kultur, är det nödvändigt att återge samspelet mellan basolateral membran integriner av tarmepitelceller och extracellulär matrix (ECM) proteiner. Laminin, kollagen IV, Fibronektin och en matris av proteoglykaner utgör intestinal epitelial ECM. 21 , 22 vi jämförde mänsklig cell-derived laminin, Fibronektin, kollagen IV och murint-derived BMM som infoga beläggningar. Endast kollagen IV stöder bildandet av stabila, långsiktiga (upp till 4 veckor) konfluenta enteroid/colonoid enskiktslager (siffrorna 1-2). Små fläckar av enskiktslager-liknande tillväxt erhölls på varje andra testade matriserna, men dessa regioner misslyckades att gå vidare till konfluens. Användning av humant kollagen IV som ECM surrogat har ett antal fördelar. BMM härrör från Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) murina sarkom celler inte är av mänskligt ursprung, medan mänskligt kollagen IV är kommersiellt tillgängliga och allmänt mer kostnadseffektivt. Dessutom BMM är en komplex blandning av proteiner med inneboende variabilitet, och kan innehålla tillväxtfaktorer som utsöndras av sarkom som påverkar genuttryck. 23
Interaktioner mellan tarmepitelceller och underliggande ECM i tarmens epitelceller restitution är fortfarande ofullständigt klarlagd. Betydelsen av kollagen IV, men inte laminin, som en vidhäftning ligand för mänskliga colonocytes24 och förstärkare av intestinal crypt epitelial cell återlämnande25 har föreslagits med antikroppar mot kollagen IV som förhindrade fastsättning . Epitelial uttryckta β1-integrin verkar vara viktigt för ECM interaktion, en antikropp som är specifik för β1-integrin betydligt blockeras vidhäftning av colonocytes till typ IV kollagen. 24 medan kollagen IV ger en tillförlitlig ECM för enteroid/colonoid enskiktslager bildandet på skären, epitelial omdaning av ECM över tiden har ännu inte utvärderats i denna modell, inte heller har påverkan av mer komplexa och definierade ECM blandningar av kollagen IV, Fibronektin och laminin.
Mänskliga enteroids/colonoids i enskiktslager format (siffrorna 1-4) aktivera manipulationer och provtagning som skulle vara besvärliga eller omöjligt att uppnå med 3D matrix-embedded kulturer. 3D enteroids/colonoids varierar i storlek, strukturella komplexitet och luminala volym, och därmed Mikroskop mikrober eller små molekyler är svåra att exakt kvantifiera. Dessutom, i motsats till enskiktslager (tabell 1) förhindra 3D kulturer direkt tillgång till både luminala och basolateral ytor att mäta joner, näringsämnen, cytokiner eller utsöndras faktorer associerade med fysiologiska och patofysiologiska processer . Konfluens (siffrorna 1-2) är en av de viktigaste egenskaperna för de enteroid/colonoid enskiktslager nödvändigt för att fastställa inte bara de fysiologiska lutningarna av näringsämnen, joner, och andra makromolekyler,16 men också skapa korrekt barriären mellan luminala bakterieflora och sterila mesenkymala/immun cell-befolkade serös miljöer. Dessa aspekter är viktiga att tänka på för framtida studier att införliva enteroid/colonoid enskiktslager med mesenkymala, immun eller neuronala celltyper att bygga mer komplexa fysiologiska modeller.
Noterade begränsningar av cell kultur infoga modellen beskrivs här är avsaknaden av fysiska krafter såsom vätska skjuvspänningen och mekanisk stretch/komprimering (peristaltiken) och avsaknad av en anaerob apikala miljö som normalt upplevs av intestinala epitel Invivo. Dessa element har potential att ta itu med mer sofistikerade microphysiological plattformar,26 , men de kräver också extra utgift, utrustning och kompetens att genomföra. Både 3D och enskiktslager kulturer är också utan interaktioner med eller bidrag från den intestinala microbiom, stromal cellpopulationer och immunförsvaret såvida dessa komponenter läggs purposefully.
Framtida tillämpningar av den enteroid/colonoid enskiktslager på kollagen IV-belagd cell kultur skär kan omfatta andra studier av drog- eller näringsämnen upptag, metabolism, toxicitet, patogena eller kommensaler mikrobiell interaktion, barriärfunktion, och funktionella Enhancement katalyseras av samtidig kultur med ytterligare intestinal celltyper. Utvärderingar kan göras inte bara inom epitel av friska givare men också från personer med genetiska mutationer eller tarm, förutsatt de Invivo fenotyperna är etablerade för att bevaras i ex vivo enteroid/colonoid kultur.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av NIH grants P01 AI125181, K01 DK106323 (JGI) och K01 DK113043 (JFA). Vi tackar James Kaper (University of Maryland, Baltimore, MD, USA) för att tillhandahålla E. coli stam HS och EHEC. Vi erkänner också de integrerade fysiologi och Imaging kärnor den Hopkins Conte mag sjukdom grundläggande Translational Research Core Center (P30 DK089502) och Johns Hopkins masspektrometri och proteomik Core.
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol | Sigma | T4661 | Tris base, Component of lysis buffer |
A-83-01 | Tocris | 2939 | ALK4/5/7 inhibitor |
Acetic acid, glacial | Fisher Scientific | A38 | |
Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | Component of growth medium |
Alexa Fluor 488 phalloidin | Life Technologies | A12379 | Fluorescent probe for F-actin |
Antibiotic/antimycotic cocktail | Invivogen | ant-pm-2 | Primocin (100x) |
B27, 50x | Life Technologies | 17504-044 | Component of growth medium |
Cell culture inserts | Corning | 3470 | Transwell, PET membrane, 0.4 μm pore, 24-well plate |
CHIR 99021 | Tocris | 4423 | GSK3β inhibitor |
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Life Technologies | C10639 | |
Collagen IV, from human placenta | Sigma | C5533 | |
Cultrex Organoid Harvesting Solution | Trevigen | 3700-100-01 | Depolymerizes basement membrane matrix |
Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) | Kaper lab, University of Maryland | ||
Epithelial voltohmmeter | World Precision Instruments | EVOM2 | |
Epithelial voltohmmeter electrode | World Precision Instruments | STX3 | |
Escherichia coli strain HS | Kaper lab, University of Maryland | ||
Ethanol, absolute | Pharmco | 111000200 | |
FluorSave mounting medium | Millipore | 345789 | For mounting insert membrane on microscope slide |
GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | L-alanyl-L-glutamine dipeptide, 200 mM |
HEK293T/Noggin-Fc cell line | van den Brink lab, Tytgat Institute for Liver and Intestinal Research | For production of Noggin conditioned medium | |
HEK293T/RSPO1-Fc-HA cell line | Trevigen | 3710-001-K | For production of Rspondin-1 conditioned medium |
HEPES, 1 M | Life Technologies | 15630-080 | Component of growth medium |
Heraeus Multifuge X1R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004250 | |
Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Fluorescent nuclear dye |
Human epidermal growth factor (EGF) | R&D Systems | 236-EG-01M | Component of growth medium |
IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | Component of lysis buffer |
Inverted cell culture light microscope | Olympus | CKX51 | |
LB broth | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
L-WNT3A cell line | ATCC | CRL-2647 | For production of Wnt3a conditioned medium |
Matrigel, growth factor reduced | Corning | 356231 | Basement membrane matrix for 3D culture |
Mini cell scraper | United BioSystems | MCS-200 | |
MUC2 antibody, mouse monoclonal | Abcam | ab11197 | Use at 1:100 for immunostaining, 1:500 for immunoblotting |
MUC2 shRNA lentiviral particles | GE Dharmacon | RHS4531 | GIPZ lentiviral shRNA, ID: 4583 |
Orbital shaker | Grant Instruments | PSU-10i | |
Penicillin-streptomycin, 100x | Life Technologies | 15140-122 | Component of growth medium |
Phosphate buffered saline | Corning | 21-031 | |
Probe sonicator with microtip | Branson Ultrasonics | 450 | |
Protease inhibitor cocktail for mammalian cells | Sigma | P8340 | Component of lysis buffer |
SB 202190 | Tocris | 1264 | p38 MAPK inhibitor |
Sodium chloride | Sigma | S3014 | Component of lysis buffer |
Sodium dexoycholate | Sigma | D6750 | Component of lysis buffer |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma | L3771 | Component of lysis buffer |
TrypLE Express, 1x | Life Technologies | 12605-010 | Trypsin, for digesting enteroid/colonoid fragments |
Vinculin antibody, rabbit monoclonal | Abcam | ab129002 | Use at 1:1000 for immunoblotting |
Water, tissue culture grade, sterile filtered | Corning | 25-055 | |
Y-27632 | Tocris | 1254 | RhoA/ROCK inhibitor |