Användning av Caenorhabditis elegans för att studera effekter av toxicants och Multigenerationseffekter
Summary
Effekterna av långlivade kemikalier över och mellan generationer är avgörande för att bedöma deras långsiktiga konsekvenser för miljön och för människors hälsa. Vi erbjuder nya detaljerade metoder för att studera trans-och multigenerationseffekter med hjälp av fri-levande Nematoden Caenorhabditis elegans.
Abstract
Information om toxiciteter av kemikalier är avgörande för deras tillämpning och avfallshantering. För kemikalier vid låga koncentrationer är långtidseffekterna mycket viktiga för att bedöma konsekvenserna för miljön och människors hälsa. För att demonstrera långsiktiga influenser, effekter av kemikalier över generationer i nyare studier ger ny insikt. Här beskriver vi protokoll för att studera effekter av kemikalier över flera generationer med hjälp av fri-levande Nematoden Caenorhabditis elegans. Två aspekter presenteras: (1) transgenerational (TG) och (2) flergenerationseffekt studier, varav den sistnämnda är separerad till multigenerationell exponering (MGE) och flera generationer kvarvarande (MGR) effektstudier. TG Effect-studien är robust med ett enkelt syfte att avgöra om kemisk exponering för föräldrar kan resultera i eventuella kvarstående konsekvenser för avkomman. Efter att effekterna mäts på föräldrarna, natriumhypokloritlösningar används för att döda föräldrarna och hålla avkomman för att underlätta effekten mätning på avkomman. TG-effektstudien används för att avgöra om avkomman påverkas när deras förälder exponeras för föroreningarna. MGE och MGR effekt studien är systematisk används för att avgöra om kontinuerlig generationsväxling exponering kan resultera i adaptiva svar hos avkomman över generationer. Noggrann hämtning och överföring används för att särskilja generationer för att underlätta effektmätningar på varje generation. Vi kombinerade också protokoll för att mäta förflyttning beteende, reproduktion, livslängd, biokemiska och genuttryck förändringar. Några exempel experiment presenteras också för att illustrera trans-och flergenerationseffekt studier.
Introduction
Tillämpningen och avfallshanteringen av kemikalier är i hög grad beroende av informationen om deras effekter vid vissa koncentrationer. I synnerhet är tid en annan viktig faktor mellan effekter och koncentrationer. Det vill säga, kemikalier, särskilt de vid låga koncentrationer i de faktiska miljöerna, behöver tid för att provocera mätbara effekter1. Därför, forskare ordna olika längder av exponeringstiden i djurförsök, och även täcka hela livscykeln. Till exempel, möss utsattes för nikotin för 30, 90 eller 180 dagar för att studera dess toxiska effekter 2. Men sådana exponeringstider räcker fortfarande inte för att belysa de långsiktiga effekterna av föroreningar (t. ex. långlivade organiska föroreningar) som kan pågå över generationer av organismer i miljön. Därför, studier om effekter över generationer får mer och mer uppmärksamhet.
Det finns två huvudaspekter i studier av generations effekter. Den första är den transgenerational (TG) effekt studie som kan kraftfullt testa om kemisk exponering för föräldrar kan resultera i några konsekvenser på avkomman3. Den andra är en multigenerational effekt studie som är mer systematisk med överväganden i både exponering och resteffekter. Å ena sidan används multigenerationseffekter (MGE) för att illustrera adaptiva reaktioner hos djuren i de långsiktiga utmanande miljöerna. Å andra sidan används de kvarvarande effekterna av flera generationer (MGR) för att påvisa de långsiktiga kvarstående konsekvenserna efter exponering, eftersom exponering för mödrar åtföljs av embryoexponering för den första avkomman och köns linjens exponering för den andra avkomma som gör den tredje avkomman som första generationen helt av exponering4.
Även om däggdjur (t. ex. möss) är modellorganismer i toxicitetsstudier, särskilt i relation till människor, är deras tillämpning att studera generations effekter ganska tidskrävande, dyrt och etiskt om 5. Organismer, inklusive kräftdjur Daphnia magna6, insekt Drosophila melanogaster7 och zebrafiskar Danio rerio8, utgör därför alternativa alternativ. Ändå saknar dessa organismer antingen likheter med människor, eller kräver särskild utrustning i studier.
Caenorhabditis elegans är en liten fri-levande Nematoden (ca 1 mm i längd) med en kort livscykel (ca 84 h vid 20 ° c)9. Denna Nematoden delar många biologiska vägar konservativ till människor, och därför har det varit mycket anställd för att illustrera effekterna av olika spänningar eller gifter10. I synnerhet, 99,5% av nematoder är hermafroditer gör denna organismer extremt lämplig för att studera generations effekter, t. ex., TG effekter av tungmetaller och sulfonamider3,11, MGE effekter av Guldnanopartiklar och tunga metaller12 och temperatur13, MGR effekter av sulfonamid14, och både MGE och MGR effekter av Gammabestrålning15 och lindan4. Dessutom konstaterades jämförbara resultat mellan effekterna av kemikalier (t. ex. zearalenon) på utveckling och reproduktion av möss och C. elegans16,17, vilket skulle ge en fördel att extrapolera effekter från detta lilla djur till människor.
Både TG-och MG-effektstudierna är tidskrävande och kräver noggrann design och prestanda. Framför allt förekom skillnader i livsförändrande val, exponeringsförhållanden och produktions separationsmetoder i ovannämnda studier. Sådana skillnader hindrade den direkta jämförelsen mellan resultaten och försvårade vidare tolkningen av resultaten. Därför är det absolut nödvändigt att upprätta enhetliga protokoll för att vägleda studier av TG och MG-effekter, och även att ge en större bild för att avslöja liknande mönster av olika gifter eller föroreningar i långsiktiga konsekvenser. Över målet med de nuvarande protokollen kommer att Visa tydliga Operations processer för att studera trans-och flergenerationseffekter med C. elegans. Protokollen kommer att gynna forskare som är intresserade av att studera de långsiktiga effekterna av gifter eller föroreningar.
Protocol
Representative Results
Discussion
För att kunna genomföra det beskrivna protokollet bör följande förslag beaktas. Utför den övergripande experimentella verksamheten i en steril miljö. Felaktig användning kan resultera i kontaminering av E. coli -stammar, t. ex., svampar och kvalster kan hindra den normala tillväxten av C. elegans och därför påverka experimentella resultat. I det avsnitt som beskriver odling av c. elegans, Observera tillväxt skalan av c. elegans på NGM agar av nakna ögon eller Mikroskop….
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| agar powder | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 9002-18-0 | |
| 79nnHT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | ||
| 96-well sterile microplate | Costar，Corning，America | ||
| Autoclave sterilizer | Tomy, Tomy Digital Biology, Japan | ||
| Biosafety cabinet | LongYue, Shanghai longyue instrument equipment co. Ltd, China | ||
| calcium chloride | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 10043-52-4 | |
| centrifuge 5417R | Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany | ||
| Centrifuge tubes | Axygen, Aixjin biotechnology (Hangzhou) co. Ltd, America | ||
| cholesterol | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 57-88-5 | |
| Dimethyl sulfoxide | VETEC, Sigmar aldrich (Shanghai) trading co. Ltd, America | 67-68-5 | |
| disodium hydrogen phosphate | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7558-79-4 | |
| ethanol | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 64-17-5 | |
| Filter | Thermo, Thermo Fisher Scientific, America | ||
| incubator | YiHeng17, Shanghai yiheng scientific instrument co. Ltd, China | ||
| inoculating loop | |||
| K2HPO4•3H2O | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 16788-57-1 | |
| kraft paper | |||
| Mcroplate Reader | Boitek, Boten apparatus co. Ltd, America | ||
| MgSO4•7H2O | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 10034-99-8 | |
| Microscopes XTL-BM-9TD | BM, Shanghai BM optical instruments manufacturing co. Ltd, China | ||
| Petri dishes | |||
| Pipette | Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany | ||
| Potassium chloride | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7447-40-7 | |
| potassium dihydrogen phosphate | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7778-77-0 | |
| Qiagen RNeasy kits | Qiagen Inc., Valencia, CA, United States | ||
| QuantiTect SYBR Green RT-PCR kits | Qiagen Inc., Valencia, CA, United States | ||
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Scientific, Wilmington, DE, United States | ||
| sodium chloride | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 7647-14-5 | |
| sodium hydroxide | Sinopharm chemical reagent company Ltd, China | 1310-73-2 | |
| sodium hypochlorite solution | Aladdin, Shanghai Aladdin biochemical technology co. Ltd, China | 7681-52-9 | |
| tryptone | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 73049-73-7 | |
| yeast extract | OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK | 119-44-8 |
Referências
- Yu, Z., Zhang, J., Hou, M. The time-dependent stimulation of sodium halide salts on redox reactants, energy supply and luminescence in Vibrio fischeri. Journal of Hazardous Materials. 342, 429-435 (2018).
- Li, W., et al. Long-term nicotine exposure induces dysfunction of mouse endothelial progenitor cells. Experimental and Therapeutic. 13, 85-90 (2017).
- Yu, Z. Y., Chen, X. X., Zhang, J., Wang, R., Yin, D. Q. Transgenerational effects of heavy metals on L3 larva of Caenorhabditis elegans with greater behavior and growth inhibitions in the progeny. Ecotoxicology and Environmental Safety. 88C, 178-184 (2013).
- Chen, R., Yu, Z., Yin, D. Multi-generational effects of lindane on nematode lipid metabolism with disturbances on insulin-like signal pathway. Chemosphere. 210, 607-614 (2018).
- Van Norman, G. A. A matter of mice and men: ethical issues in animal experimentation. International Anesthesiology Clinics. 53 (3), 63-78 (2015).
- Pereira, C. M. S., Everaert, G., Blust, R., De Schamphelaere, K. A. C. Multigenerational effects of nickel on Daphnia magna depend on temperature and the magnitude of the effect in the first generation. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (7), 1877-1888 (2018).
- Morimoto, J., Simpson, S. J., Ponton, F. Direct and trans-generational effects of male and female gut microbiota in Drosophila melanogaster. Biology Letters. 13, 20160966 (2017).
- Coimbra, A. M., et al. Chronic effects of clofibric acid in zebrafish (Danio rerio): A multigenerational study. Aquatic Toxicology. 160, 76-86 (2015).
- Sugi, T. Genome editing in C. elegans and other nematode species. International Journal of Molecular Sciences. 17, 295 (2016).
- Leung, M. C. K., et al. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicological Science. 106 (1), 5-28 (2008).
- Yu, Z. Y., Jiang, L., Yin, D. Q. Behavior toxicity to Caenorhabditis elegans transferred to the progeny after exposure to sulfamethoxazole at environmentally relevant concentration. Journal of Environmental Sciences-China. 23 (2), 294-300 (2011).
- Kim, S. W., Kwak, J. I., An, Y. J. Multigenerational study of gold nanoparticles in Caenorhabditis elegans: transgenerational effect of maternal exposure. Environmental Science & Technology. 47, 5393-5399 (2013).
- Klosin, A., Casas, E., Hidalgo-Carcedo, C., Vavouri, T., Lehner, B. Transgenerational transmission of environmental information in C. elegans. Science. 356, 320 (2017).
- Yu, Z. Y., et al. Trans-generational influences of sulfamethoxazole on lifespan, reproduction and population growth of Caenorhabditis elegans. Ecotoxicology and Environmental Safety. 135, 312-318 (2017).
- Buisset-Goussen, A., et al. Effects of chronic gamma irradiation: a multigenerational study using Caenorhabditis elegans. Radioactivity. 137, 190-197 (2014).
- Zhao, F., et al. Multigenerational exposure to dietary zearalenone (ZEA), anestrogenic mycotoxin, affects puberty and reproductionin female mice. Reproductive Toxicology. 47, 81-88 (2014).
- Yang, Z., Wang, J., Tang, L., Sun, X., Xue, K. S. Transgenerational comparison of developmental and reproductive toxicities in zearalenone exposed Caenorhabditis elegans. Asian Journal of Ecotoxicology. 11 (4), 61-68 (2016).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis dlegans. Genética. 77, 71-94 (1974).
- Emmons, S., Klass, M., Hirsch, D. An analysis of the constancy of DNA sequences during development and evolution of the nematode Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 1333-1337 (1979).
- Van Gilst, M. R., Hadjivassiliou, H., Yamamoto, K. R. A Caenorhabditis elegans nutrient response system partially dependent on nuclear receptor NHR-49. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (38), 13496-13501 (2005).
- Cobb, E., Hall, J., Palazzolo, D. L. Induction of metallothionein expression after exposure to conventional cigarette smoke but not electronic cigarette (ECIG)-generated aerosol in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Physiology. 9, 426 (2018).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Hill, R., et al. Genetic flexibility in the convergent evolution of hermaphroditism in Caenorhabditis Nematodes. Developmental Cell. 10, 531-538 (2006).
- Cabreiro, F., Gems, D. Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans. EMBO Molecular Medicine. 2013, 1300-1310 (2013).
- Breider, F., von Gunten, U. Quantification of total N-nitrosamine concentrations in aqueous samples via UV-photolysis and chemiluminescence detection of nitric oxide. Analytical Chemistry. 89 (3), 1574-1582 (2017).
