Konfokal Live Imaging af skyde apikale ildens fra forskellige plantearter
Summary
Denne protokol præsenterer sådan live billede og analysere skyde yderste ildens fra forskellige plantearter ved hjælp af laser scanning Konfokal mikroskopi.
Abstract
Skyde yderste meristem (SAM) fungerer som en opbevaret stamceller reservoir og det genererer næsten alle overjordiske væv under den postembryonic udvikling. Aktivitet og morfologi af SAMs bestemme vigtige agronomiske egenskaber, såsom skyde arkitektur, størrelse og antal af reproduktive organer, og vigtigst, korn udbytte. Her give vi en detaljeret protokol til at analysere både overflade morfologi og den interne cellestruktur af levende SAM’er fra forskellige arter gennem laser scanning Konfokal mikroskop. Hele proceduren fra prøveforberedelsen til erhvervelse af billeder i høj opløsning tredimensional (3D) kan opnås inden for så kort som 20 minutter. Vi vise, at denne protokol er yderst effektiv til at studere ikke blot blomsterstand SAMs model arter, men også de vegetative ildens fra forskellige afgrøder, giver en simpel men kraftfulde værktøj til at studere organisation og udvikling af ildens på tværs af forskellige plantearter.
Introduction
Plante meristem indeholder en pulje af udifferentierede stamceller og løbende opretholder orgel plantevækst og udvikling1. Under den postembryonic udvikling stammer næsten alle overjordiske væv af en plante fra skyde yderste meristem (SAM). I afgrøder er aktivitet og størrelsen af SAM og dens afledte floral ildens tæt forbundet med mange agronomiske træk som skyde arkitektur, frugtproduktion og frø udbytte. For eksempel, i tomat forårsager et udvidet SAM en stigning i skuddet og blomsterstand forgrening, og dermed resultaterne i generere ekstra blomst og frugt organer2. I majs fører en stigning i SAM størrelse til en højere frøantal og samlede afkast3,4. I sojabønner, meristem indetermination er også tæt forbundet med skyde arkitektur og give5.
Morfologi og anatomi af SAMs kan være kendetegnet ved flere forskellige metoder, herunder histologiske skæring/farvning og scanning elektronmikroskopi (SEM)6, som begge har meget avancerede meristem forskning gennem at give enten den sektionsvisning eller en tre-dimensionelle (3D) overflade visning af SAMs. Men begge metoder er tidskrævende, der involverer flere eksperimenterende trin fra prøveforberedelsen til dataopsamling, og disse metoder afhænger hovedsagelig af faste prøver. De seneste fremskridt i laser scanning konfokalmikroskopi teknik har overvundet disse begrænsninger og give os et kraftfuldt værktøj til at undersøge de cellulære struktur og udviklingsmæssige proces af plante væv og organer7,8. Gennem optiske snarere end fysisk væv skæring, Konfokal mikroskopi tillader indsamling af en serie af z-stak billeder og den efterfølgende 3D rekonstruktion af prøven gennem billede analyse software.
Her beskriver vi en effektiv procedure for at undersøge både inde og overfladen strukturer af levende SAM’er fra forskellige plantearter ved hjælp af laser scanning Konfokal mikroskopi, som potentielt giver forskere til at udføre alle de eksperimentelle proces inden for så kort som 20 minutter. Forskellige fra andre offentliggjorte metoder til live Konfokal billeddannelse af Arabidopsis blomsterstand SAMs9,10,11,12,13,14, 15 og Arabidopsis blomster12,13, her vi vise, at denne protokol er yderst effektiv til at studere ikke blot blomsterstand ildens model arter, men også den vegetative skyde yderste ildens fra forskellige afgrøder som tomat og sojabønner. Denne metode er ikke afhængig af transgene fluorescerende markører, og potentielt kan anvendes til at studere skyde ildens fra mange forskellige arter og sorter. Derudover introducerer vi også den simple billedbehandling trin til visning og analyse af forskellige SAMs i en 3D-visning. Tilsammen, vil denne simple metode lette forskere bedre forståelse både struktur og udviklingsmæssige proces af ildens fra både modelorganismer og afgrøder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her, vi beskriver en simpel billedbehandling metode, der kan anvendes til studiet af skyde yderste ildens fra forskellige planter med mindre modifikation, åbne en ny avenue for at studere meristem regulering på både vegetative og reproduktive stadier i model planter og afgrøder. I modsætning til SEM og histologiske farvning metoder, kan denne protokol hjælpe afsløre både overflade Se og intern cellulære strukturer af SAMs, uden behov for arbejdskrævende prøve fiksering og/eller væv skæring trin. Denne protok…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkender Purdue Bindley Bioscience Center Imaging facilitet for adgang til laser scanning Konfokal mikroskop og den tekniske støtte, og forfatterne sætter pris på hjælp fra Andy Schaber i Purdue Bindley Imaging facilitet. Denne aktivitet blev finansieret af Purdue University som en del af AgSEED korsvej finansiering til støtte for Indianas landbrug og udvikling af landdistrikter.
Materials
| Agar Phyto | Dot Scientific Inc. | DSA20300-1000 | |
| Agarose | Dot Scientific Inc. | AGLE-500 | |
| Forceps | ROBOZ | RS-4955 | Dumont #5SF Super Fine Forceps Inox Tip Size .025 X .005mm, for dissecting shoot apices. |
| LSM 880 Upright Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Murashige & Skoog MS medium | Dot Scientific Inc. | DSM10200-50 | |
| Plan APO 20x/1.1 water dipping lens | Zeiss | ||
| Plastic petri dishes 100 mm X 15 mm | CELLTREAT Scientific Products | 229694 | Use as making MS plates |
| Plastic petri dishes60 mm X 15 | CELLTREAT Scientific Products | 229665 | Use as imaging dishes |
| Propagation Mix | Sungro Horticulture | ||
| Propidium iodide | Acros Organics | 440300250 | 1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls |
| Razor blade | PERSONNA | 62-0179 | For cutting shoot apex from plants |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Tissue | VWR | 82003-820 | |
| Zen black | Zeiss | Image acquisition software |
Referências
- Meyerowitz, E. M. Genetic control of cell division patterns in developing plants. Cell. 88 (3), 299-308 (1997).
- Xu, C., et al. A cascade of arabinosyltransferases controls shoot meristem size in tomato. Nature Genetics. 47 (7), 784-792 (2015).
- Bommert, P., Nagasawa, N. S., Jackson, D. Quantitative variation in maize kernel row number is controlled by the FASCIATED EAR2 locus. Nature Genetics. 45 (3), 334-337 (2013).
- Je, B. I., et al. Signaling from maize organ primordia via FASCIATED EAR3 regulates stem cell proliferation and yield traits. Nature Genetics. 48 (7), 785-791 (2016).
- Ping, J., et al. Dt2 is a gain-of-function MADS-domain factor gene that specifies semideterminacy in soybean. Plant Cell. 26 (7), 2831-2842 (2014).
- Vaughan, J. G., Jones, F. R. Structure of the angiosperm inflorescence apex. Nature. 171, 751 (1953).
- Sijacic, P., Liu, Z. Novel insights from live-imaging in shoot meristem development. Journal of Integrative Plant Biology. 52 (4), 393-399 (2010).
- Tax, F. E., Durbak, A. Meristems in the movies: live imaging as a tool for decoding intercellular signaling in shoot apical meristems. Plant Cell. 18 (6), 1331 (2006).
- Grandjean, O., et al. In vivo analysis of cell division, cell growth, and differentiation at the shoot apical meristem in Arabidopsis. Plant Cell. 16 (1), 74-87 (2004).
- Heisler, M. G., Ohno, C. Live-imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem. Methods in Molecular Biology. 1110, 431-440 (2014).
- Tobin, C. J., Meyerowitz, E. M. Real-time lineage analysis to study cell division orientation in the Arabidopsis shoot meristem. Methods in Molecular Biology. 1370, 147-167 (2016).
- Prunet, N. Live confocal Imaging of developing Arabidopsis flowers. Journal of Visualized Experiments. (122), e55156 (2017).
- Prunet, N., et al. Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds. Biologia do Desenvolvimento. 419, 114-120 (2016).
- Reddy, G. V., Heisler, M. G., Ehrhardt, D. W., Meyerowitz, E. M. Real-time lineage analysis reveals oriented cell divisions associated with morphogenesis at the shoot apex of Arabidopsis thaliana. Development. 131, 4225-4237 (2004).
- Nimchuk, Z. L., Perdue, T. D. Live Imaging of Shoot Meristems on an Inverted Confocal Microscope Using an Objective Lens Inverter Attachment. Frontiers in Plant Science. 8, 773 (2017).
- Zhou, Y., et al. HAIRY MERISTEM with WUSCHEL confines CLAVATA3 expression to the outer apical meristem layers. Science. 361 (6401), 502-506 (2018).
- Zhou, Y., et al. Control of plant stem cell function by conserved interacting transcriptional regulators. Nature. 517 (7534), 377-380 (2015).
- Nimchuk, Z. L., Zhou, Y., Tarr, P. T., Peterson, B. A., Meyerowitz, E. M. Plant stem cell maintenance by transcriptional cross-regulation of related receptor kinases. Development. 142 (6), 1043 (2015).
- Li, W., et al. LEAFY Controls Auxin Response Pathways in Floral Primordium Formation. Science Signaling. 6 (270), ra23 (2013).
- Truernit, E., et al. High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis. Plant Cell. 20 (6), 1494-1503 (2008).
