Den transimmunization (ti) enhed eller plade og relaterede protokoller er blevet udviklet til at replikere de vigtigste funktioner i ekstraor poreal foto kemoterapi (ECP), i en eksperimentel indstilling, giver mulighed for produktion af fysiologisk aktiveret, tunbar dendritiske blodlegemer (DCs) til kræft immunterapi.
Ekstrudorporeal foto kemoterapi (ECP) er en udbredt kræft immunterapi for kutan T-celle-lymfom (CTCL), operative i over 350 universitetscentre på verdensplan. Mens ECP’S kliniske effekt og eksemplariske sikkerhedsprofil har været drivkraften bag den udbredte anvendelse, er det fortsat en udfordring at belyse de underliggende mekanismer, til dels på grund af manglende laboratorie-ECP-model. For at overvinde denne forhindring og skabe en enkel, brugervenlig platform for ECP-forskning, udviklede vi en nedskaleret version af den kliniske ECP leukocyt-behandlingsenhed, velegnet til arbejde med både musemodeller og små humane blodprøver. Denne anordning kaldes Transimmunization (TI) kammer eller plade. I en række skelsættende eksperimenter, den miniature enhed blev brugt til at producere en cellulær vaccine, der regelmæssigt initieret terapeutisk anti-cancer immunitet i flere murinsynogene mus tumormodeller. Ved at fjerne individuelle faktorer fra det eksperimentelle system og fastslå deres bidrag til in vivo anti-tumorrespons, vi derefter belyst centrale mekanistiske førere af ECP immuniserende potentiale. Kollektivt, vores resultater afslørede, at anti-tumor effekter af ECP initieres af dendritiske celler (DC), fysiologisk genereret gennem blod monocyt interaktion med blodplader i ti-pladen, og lastet med antigener fra tumorceller, hvis apoptotiske celle døden fintitreres fint ved udsættelse for det fotoaktivatable DNA-kryds linende middel 8-methoxypsoralen og UVA-lys (8-MOPA). Når det returneres til musen, denne cellulære vaccine fører til specifikke og overførbare anti-tumor T celle immunitet. Vi efterprøvede, at TI kammer er også egnet til humant blodbehandling, producerer humane DCs fuldt sammenlignelig i aktiveringstilstand og profil til dem, der stammer fra det kliniske ECP kammer. Protokollerne præsenteret her er beregnet til ECP undersøgelser i mus og mand, kontrolleret generation af apoptotiske tumorceller med 8-MOPA, og hurtig produktion af fysiologisk menneskelige og mus monocyte-afledte DCS for en bred vifte af applikationer.
Extracorporeal foto kemoterapi (ECP) er en etableret immunterapi, der er bredt operativt i universitetscentre over hele verden. Dens anvendelse er blevet drevet af unikke selektivitet, sikkerhed, og tovejs effekt af ECP terapi, egenskaber, som ECP deler med det fysiologisk immunsystem selv, som det ser ud til at partner. ECP er selektivt immuniserende mod de maligne celler i kutan T-celle-lymfom (ctcl)1,2, og selektivt tolerizing for målrettede antigener i transplantation, autoimmunitet, og graft-versus-Host disease (gvhd) indstillinger 3 af , 4. ecp’s immunogenicitet fremhæves ved sin afhængighed af et intakt CD8 T-celle segment i ctcl5, mens specificitet afspejles i ecp’s meget gunstige bivirkningsprofil, uden immunsuppression i transplantation eller GvHD-indstillinger og ingen øget opportunistisk infektions følsomhed i CTCL, hvor ikke-patogene T-celle kloner potentielt kan gå tabt sammen med de maligne T-celler.
I betragtning af den kliniske betydning af ECP, håb om, at en bedre forståelse af sine mekanismer kan udvide ECP’S terapeutiske rækkevidde til et bredere spektrum af kræft og immunologiske lidelser har stimuleret international interesse. To nationalt godkendte workshops, en National Institutes of Health (NIH) State-of-The-Science Symposium6 og en American Society for Aperesis konsensuskonference7, blev gennemført og rapporteret, med henblik på at fremskynde identifikation af de vigtigste cellulære bidragydere til ECP’S anti-cancer og tolerogene virkninger.
Til dato, på trods af talrige offentliggjorte rapporter forsøger at løse ECP’S mekanisme, to primære forhindringer har hæmmet videnskabelige fremskridt. For det første er undersøgelsen af ECP-mekanismerne i forsøgslaboratoriet blevet begrænset af manglen på en miniature-ECP-enhed, der fuldt ud afspejler ECP’S cellulære og in vivo-virkninger og gælder for dyremodeller. For det andet er dybdegående laboratorieanalyse af ECP-prøver i den kliniske indstilling blevet begrænset af den begrænsede tilgængelighed af ECP-behandlede patient immunceller, som kræver adgang til behandlingscentre, og er desuden underlagt tidspunktet for patientens infusioner, og det etiske behov for kompromisløs sæt af patient-reinfbrugt leukocytter.
For at løse de forhindringer, der hæmmer udviklingen af ECP-forskning, satte vi os for at udvikle et miniature-ECP-apparat, der mest efterligner de centrale elementer i terapien. Standard ECP behandling involverer passage af en patients leukaferese-beriget leukocytter gennem en 1 mm-tyk, ultraviolet et lys (UVA)-transparent, plastik plade6,8. I pladen udsættes leukocytterne for 8-methoxypsoralen (8-MOP), et foto-aktivatable stof, som ved UVA-eksponering transitært omdannes til en reaktiv form (8-MOPa), som er i stand til at gennemføre DNA-krydsbinding via dets bivalente bindinger til pyrimidin-baser på søster DNA-tråde9,10. Behandlede, 8-MOPA-behandlede leukocytter opsamles og returneres intravenøst til patienten.
Da ECP selv er en bi-directional terapi, immunisering i kræft og tolerizing i transplantation, autoimmunitet og GvHD indstillinger, for afklaring vi har navn lagt model ECP’S immunisering mode “transimmunization”, og den tolerogene mode “transtolerization”. Vi fokuserede først på transimmunization-modalitet. Vores nyligt rapporterede miniature skalerbare mus-til-mand ECP enhed, transimmunization (ti) kammer eller plade, og den tilsvarende protokol, gengive både cellulære og in vivo effekter af den menneskelige ECP enhed i en kræft indstilling11.
For at gøre transimmunization in vivo model så klinisk relevant som muligt, vi indledte immunterapi efter subkutant injicerede murinsynogene mus tumorer blev håndgribelig, og dermed teste protokollens effektivitet i etablerede kræft. På samme måde som ECP i ctcl, den proof-of-princip transimmunization protokol i yumm 1.7 model af melanom bruger perifert blod mononukleære celler (PBMC) fra tumor-bærende dyr. Cellerne passerer gennem TI-pladen under strømning. Mens 8-MOPpt behandling af celler i miniature kammeret er mulig, er det at foretrække at gennemføre det separat, for at sikre, at kun den ønskede celletype er udsat for 8-MOPa. Tidligere undersøgelser indikerer, at ECP’S tolerogene virkning medieres af 8-MOPA-skadede antigen-præsenterer celler12, mens den immuniserende effekt kræver 8-MOPpt skade på måltumor cellerne11. I transimmunization protokol enten tumorceller, eller immunceller, kan selektivt udsættes for 8-MOPA efter behov. Da maksimering af kontakttiden mellem 8-MOPA-skadede tumorceller og ECP-induceret dendritiske celler (DC) har vist sig at øge den immunotherapeutiske kapacitet af klinisk ECP13, vi indarbejdet en overnatning Co-inkubation skridt ind i vores protokol. Efter overnatning inkubation returneres de behandlede celler til det tumor bærende dyr.
Dette system pålideligt reduceret tumorvækst og initieret specifik anti-tumor immunitet i mus med etablerede murinsynogene tumorer11, og tillod os at dissekere mekanismen af ecp’s kliniske anti-tumor effektivitet. I flere undersøgelser har vi påvist, at ECP immunitet initieres gennem ex vivo trombocytaktivering i ti-pladen14,15. Aktiverede trombocytter signalerer efterfølgende monocyt-til-dendritisk celle modning14, hvilket fører til produktion af fysiologisk DCS. De nydannede monocyte-afledte DCs er i stand til at kryds præsentere internaliserede antigener fra 8-MOPA-beskadigede tumorceller for at aktivere antigen-specifikke T-celle respons16. Som foreslået tidligere12,17, dog, 8-MOPA-induceret skade af den spirende DCS selv kan modvirke eller endda vende den anti-tumor effekt11, hvilket giver en mekanistisk link til ECP tolerance.
TI-pladen er også blevet brugt til at fremstille fysiologisk aktiverede DCs fra humant PBMC. På samme måde som muse undersøgelserne er de humane TI-afledte DCs-produkter afhængige af plade passage i nærværelse af blodplader til deres generation, forekommer phenotypiske identiske med dem, der produceres i den kliniske ECP-plade, og er i stand til effektivt at behandle og Cross-præsentation af humane tumor antigener til aktivering af humane T-celler11,16.
I afdække mekanismen af ECP immunterapi, har vi derfor afdækket en metode til hurtigt at generere fysiologisk mus og menneskelige dendritiske celler af ønsket antigen specificitet, der kan funktionelt moduleret. Den innovative TI enhed og protokol har betydelig potentiel betydning inden for ECP forskning og terapi og kræft immunterapi mere bredt, og i alle andre områder med interesse i fysiologisk, funktionelle dendritiske celler i enten immuniserende eller den tolerizing modalitet. Vi håber, at denne publikation vil give dem, der har interesse i sådanne forskningsområder, de nødvendige værktøjer.
Den miniaturiserede anordning og protokol beskrevet ovenfor for første gang giver mulighed for effektiv laboratorieundersøgelse af mekanismerne i ECP i mus eksperimentelle systemer, og i små humane blodprøver. Dette er et stort fremskridt; for eksempel, det gav os mulighed for at demonstrere for første gang effekten af transimmunization mod solide tumorer i en mus model 11, åbne den fremtidige mulighed for en lignende anvendelse i menneskelig onkologi.
Forud for udviklingen af den transimmunization enhed og metode, der er beskrevet her, var det umuligt fuldt ud at undersøge alle aspekter af ECP. I musemodeller, selv om 8-MOPet aspekt af behandlingen kunne replikeres noget ved at behandle celler i en Petri skål12,20, der var ingen kapacitet til at integrere i den metode, pladen passage, som har vist sig at giver dynamiske trombocytinteraktioner, som er af afgørende betydning for ECP’S fysiologiske DC-aktivering14. I humane studier, alternativt, flow komponenten var fuldt til stede, men evnen til selektivt eksponere specifikke cellulære komponenter til 8-MOPA, eller for at beskytte dem mod det, manglede21,22. Dette forhindrede den fulde forståelse af ECP mekanisme, og dens optimering for immunitet eller tolerance. Desuden er den mængde blod, der kræves for at arbejde med det kliniske ECP-apparat, stor og hæmmer den videnskabelige undersøgelse. Den miniaturiserede ECP enhed og protokol beskrevet her for første gang giver mulighed for effektiv, fuldt fleksibel og tunable laboratorie ECP modellering. Hertil kommer, at TI-pladen giver mulighed for real-time visualisering og overvågning af celle interaktioner inden for pladen ved mikroskopi.
For protokollens succes ved hjælp af både in vivo og ex vivo systemer, er det afgørende, at den behandlede PBMC indeholder monocytter, der kan aktiveres i funktionelle DCs. For at denne aktivering kan fortsætte, er det også nødvendigt at sikre, at PBMC-brøken indeholder et fysiologisk antal raske, aktivatable trombocytter, og at TI-pladens passage protokol følges nøje. For at dirigere de nyligt aktiverede DCs mod en specifik reaktivitet skal de være forsynet med antigen. Vi har konstateret, at den mest effektive metode til antigen levering for anti-cancer immunitet er overnight Co-inkubation af de nyligt aktiverede DCs med antigen-holdige 8-MOPA-eksponerede tumorceller. Dette har den ekstra fordel at være i stand til at skabe en immunogen anti-cancer respons uden at det nødvendiggør forudgående kendskab til tumor antigener, ved at tillade DCs at vælge dem. Men i tilfælde, hvor antigenet er kendt, vi havde en vis succes i ex vivo-systemer, når du bruger gratis peptider som antigener i co-inkubation. For immunogeniske anvendelser skal DCs selv beskyttes modpt eksponering på 8 MOP. Endelig, i in vivo eksperimenter, er det vigtigt at arbejde med en dyremodel, der er i stand til anti-tumor immunitet. Transimmunization virker ved at skabe aktiverede, antigen-specifikke DCs, som arbejder i kroppen til at initiere medfødt og adaptiv immunrespons. Nedsat aktivitet eller mangel på NK-, CD4-eller CD8 T-celler i den behandlede mus vil påvirke protokollens effekt5,11.
Mens den protokol, der er beskrevet her, er en proof-of-princip en, der er blevet optimeret til en mus solid murinsynogene tumor model, det alligevel afslører mange muligheder. Mekanismerne i ECP i onkologi er kun lige blevet belyst, og der er stadig meget plads til bedre forståelse. Mere bredt, evnen til at generere fysiologisk aktiveret mus og humane DCs, og selektivt dirigere dem mod antigen-specifikke immunitet har mange potentielle anvendelser ud over kræft. Evnen til at gøre det samme, men i stedet dirigere DCs mod antigen-specifikke tolerance, som det foreslås af tolerizing effekten af ECP selv, har også vidtrækkende medicinske implikationer. Med denne metode, håber vi at give de værktøjer og åbne en produktiv Avenue af forskning for alle med en interesse i fysiologisk DC behandlinger.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af NIH-NCI spore Grant 1 P50 CA121974 (R. Edelson, M. Girardi); NIH Cancer Center støtte tilskud 3 P30 CA16359-28S1 (R. Edelson, M. Girardi); Howard Hughes Medical Institute uddannelse stipendium (A. Vassall); og NY kardiel Foundation (R. Edelson, A. Ventura, A. Vassall, H. Ezaldein). Der blev ydet delvis støtte af R01 CA196660-01 til M. Bosenberg.
Forfatterne er taknemmelige for Dr. Robert Tigelaar for hans mentorordning, vejledning og eksperimenterende indsigt. Vi takker vores kolleger hos Fraunhofer IBMT, især Dr. Thorsten Knoll, for at udvikle og levere ECP-ækvivalent TI kammer. Nicholas Theodosakis venligt hjulpet med indledende stadier af YUMM eksperimenter. Vi takker vores frivillige bloddonorer, Inger Christensen og hendes professionelle personale på Yale ECP Treatment Center for hjælp med frivillige blod indkøb. Dr. Wendell Yarbrough og Dr. Natalia Issaeva venligt delt med os SCC61 og SCC61-E6/7 cellelinjer. For teknisk assistance på projektet, takker vi Dr. Julia Lewis for FACS protokol rådgivning, og E. Menet, G. Tokmoulina, C. Cote på Yale FACS Core. Film billeder af celler i TI-pladen blev erhvervet med assistance fra Felix Rivera-Molina, PhD, dept of Cell Biology og Yale CINEMA Imaging Center, Yale School of Medicine. Filmproduktion blev overvåget af Andrew Osborne, Senior video producer, Office of Communications, Yale School of Medicine.
8-MOP (UVADEX 20ug/mL, 10 mL) | Therakos, Inc | Rx only, NDC No. 64067-0216-01 | Protocol steps 3 and 8 – mouse and human 8-MOP/UVA treatment of cells |
AB serum | Lonza BioWhittaker | 14-498E | Protocol step 8.5 – overnight culture of human PBMC |
ACK red cell lysis buffer | Lonza BioWhittaker | 10-548E | Protocol step 2 – mouse PBMC preparation |
Anesthesia Tabletop V1 system with active scavenging | VetEquip | 901820 | Protocol steps 1 and 7 – mouse sc tumor introduction and TI administration |
Autologous mouse plasma | prepare in lab | n/a | Prepare per protocol step 2.4, use in 7.1 – mouse TI treatment administration |
Autologous mouse serum | prepare in lab | n/a | Prepare per protocol step 5, use in step 6.1 – overnight culture of mouse PBMC |
C57Bl/6J mice | Jackson labs | 0000664 | Protocol steps 1, 2, 5 and 7 – mouse tumor injection, blood/serum collection, and therapy return |
Cheek bleed GoldenRod lancet, 5 um | Medipoint | 9891620 | Protocol step 2 – mouse PBMC preparation |
Clear RPMI | Gibco by LifeTech | 11835-030 | Protocol steps 6 and 8 – overnight culture of mouse/human PBMC |
DMEM/F12 | Gibco by LifeTech | 11330-032 | Protocol steps 1 and 2 – YUMM1.7 cell culture |
EasyGrip Petri Dishes, 35mm | Falcon | 351008 | Protocol steps 5 and 8 – overnight culture of mouse/human PBMC |
Eppendorf 1.5mL conical tubes | DOT scientific | 1700-GMT | Protocol steps 1-8 |
FBS (fetal bovine serum, heat-inactivated) | SAFC Biosciences | 12306C-500mL | Protocol steps 1-4 – YUMM1.7 cell culture, 8-MOP/UVA treatment of cells, TI plate |
Hemavet 950FS hematology counter | Drew Scientific | HV950FS | Protocol step 8.2 – monitoring human platelet numbers |
Heparin 5,000U/mL | McKesson Packaging services | 949512 | Protocol steps 2 and 8 – mouse and human PBMC preparation |
Isoflurane | Abbott Laboratories | 5260-04-05 | Protocol steps 1 and 7 – mouse sc tumor introduction and TI administration |
Lympholyte M lymphocyte isolation medium | Cedarlane Labs | CL5035 | Protocol step 2 – mouse PBMC preparation |
Non-essential amino acids | Gibco by LifeTech | 11140-050 | Protocol steps 1 and 2 – YUMM1.7 cell culture |
PBS (1x DPBS, (-) Ca+2, (-) Mg+2) | Gibco by LifeTech | 14190-144 | Protocol steps 1-7 |
Pen/strep | Gibco by LifeTech | 15140-122 | Protocol steps 1 and 2 – YUMM1.7 cell culture |
Polypropylene 15mL conical tubes | Falcon | 352097 | Protocol steps 1-8 |
Programmable 2-channel syringe pump | New Era Pump Systems Inc | model NE-4000 | Protocol steps 4 and 8 – running the TI plate |
Retro-orbital injection needles, 27G x 1/2 | BD Biosciences | 305109 | Protocol step 7 – mouse TI treatment administration |
Syringes, 10mL (LUER-LokTip) | BD Biosciences | 309604 | Protocol steps 4, 8 – running the TI plate |
Syringes, 1mL (Slip tip) | BD Biosciences | 309659 | Protocol steps 1, 4, 7, 8 |
TI plate and tubing set | Transimmune AG | not commercially available | Please contact Prof. R. Edelson or Transimmune in order to obtain the device on a collaborative basis. |
TI plate running platform | Transimmune AG | not commercially available | Please contact Prof. R. Edelson or Transimmune in order to obtain the device on a collaborative basis. |
Tissue culture flasks, T75 (75 cm2) | Falcon | 353136 | Protocol steps 1, 2, 6 and 8 – mouse and human cell culture |
Tissue culture plates, 12-well | Falcon | 353043 | Protocol steps 3 and 8 – mouse and human 8-MOP/UVA treatment of cells |
Tissue culture scrapers | Falcon | 353085 | Protocol steps 6 and 8 – overnight culture of mouse/human PBMC |
Trypsin-EDTA 0.25% (1x) | Gibco by LifeTech | 25200-056 | Protocol steps 1 and 2 – YUMM1.7 cell culture |
Tumor injection needles, 25G x 5/8 | BD Biosciences | 305122 | Protocol step 1 – mouse subcutaneous tumor introduction |
UVA irradiator | Johnson and Johnson | not commercially available | The apparatus was specifically developed by J&J for Prof. R. Edelson's laboratory. Several machines are available in the laboratory on a collaborative basis; please contact Prof. R. Edelson for use of one. Alternative UVA irradiators are commercially available but have not been tested by us. |
Invitrogen EVOS FL Auto 2 Imaging System | Invitrogen | fluorescence imaging instrument |