HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA 라이브러리 심사 식별 중요 CTCF 경계
Summary
CRISPR/sgRNA 라이브러리 질의 단백질 코딩 유전자에 적용 되었습니다. 그러나, 유전자 규칙에서 CTCF 경계의 기능을 밝히기 위해 sgRNA 라이브러리의 미개척 남아 있습니다. 여기, 우리는 HOX loci 특정 sgRNA 라이브러리 CTCF 경계 HOX loci의 기능을 명료 하 게 설명 합니다.
Abstract
CCCTC-바인딩 요소 (CTCF)-안정적인 도메인 토폴로지가 연결 (TADs) TADs 이웃에 있는 DNA 요소의 제약 상호 작용에 중요 한 역할을 할 중재. CTCF 배아 발달, 신체 모방, 조, 및 leukemogenesis 제어 하는 HOX 유전자의 공간 및 시간 표현 조절에 중요 한 역할을 한다. 그러나, 그것은 크게 알 수 없는 남아 여부와 HOX loci 관련 CTCF 경계 chromatin 조직과 HOX 유전자 발현을 조절 하는 방법. 현재 프로토콜에서 HOXA/B/C/D loci에서 모든 CTCF 바인딩 사이트를 타겟팅 하는 특정 sgRNA 풀링된 라이브러리 생성 CTCF 관련 chromatin 경계 태 드 형성과 HOX 유전자에 방해의 효과 검사 하 식입니다. CRISPR-Cas9를 통해 유전자 검사, HOXA7/HOXA9 유전자 (CBS7/9) 사이 위치한 CTCF 바인딩 사이트 종양 chromatin 도메인으로 소성 HOX 유전자를 유지 하기 위한 중요 하 고 중요 한 레 귤 레이 터로 확인 되었습니다. MLL 재배열 급성 골수성 백혈병 (AML)에 식 패턴. 따라서,이 sgRNA 접근 차단 특정 유전자 loci에서 중재 CTCF 게놈 조직에 새로운 통찰력을 제공 도서관과 또한 두 코딩 주석된 유전 규제 요소 기능 특성에 대 한 기초를 제공 하 고 noncoding 포스트 인간 게놈 프로젝트 시대에 정상적인 생물학 과정.
Introduction
최근 게놈 상호 작용 연구 밝혀 인간의 핵 게놈 형태 토폴로지가 연결 도메인 (TADs) 세포 유형 및 종 보존을 안정. 별도 도메인으로 게놈의 조직 촉진 하 고 규제 요소 (예: 강화 및 발기인) 간의 상호 작용을 제한. CCCTC-바인딩 요소 (CTCF) 태 드 경계 한다 이웃 TADs1에 있는 DNA 요소의 제약 상호 작용에서 중요 한 역할을 한다. 그러나, 게놈 넓은 CTCF 바인딩 데이터 CTCF 주로 상호 작용 하는 다른 세포 유형에 동일한 DNA 사이트, 비록 자주 작동 하는지 다른 제안에 한 셀만 특정 사이트에서 chromatin 장벽으로 밝혀 그 CTCF 기능 함께 chromatin 경계2의 형성에 다른 활동. 알 수 없는 남아 여부 경계 요소 (CTCF 바인딩 사이트) 직접 CTCF의 생물학 기능에 연결 되 고 이러한 링크 발생 하는 방법 이다. 따라서, 우리는 게놈에 특정 CTCF 바인딩 사이트 직접 TADs의 형성을 조절 및 이러한 도메인 내에서 또는 이웃 도메인 간에 발기인/증강 상호 작용을 제어 가설. 인간과 마우스 게놈 시퀀싱 프로젝트 후속 epigenetic 분석 완료 게놈의 새로운 분자 및 유전 서명을 발견 했습니다. 그러나, 유전자 규칙 및 세포질 기능을, 뿐만 아니라 그들의 분자 따라 장치를 마더보드에, 특정 서명/수정 역할은 아직 완전히 이해 될.
증거의 여러 줄 CTCF 중재 TADs 기능 chromatin 도메인3,4,5대표 지원 합니다. 비록 CTCF 주로 상호 작용 하는 다른 세포 유형에 동일한 DNA 사이트, 게놈 넓은 CTCF 칩 seq 데이터 CTCF 종종 다른2에 한 셀만 chromatin 장벽 기능 공개 했다. CTCF 게놈 조직4,,67중재 하 여 개발 시 필수적인 역할을 재생 합니다. CTCF 경계의 증강/발기인 상호 작용, 유전자 발현, 발달 방해로 이어지는 손상. 이것은 CTCF TADs 중재 구조 구성 요소 뿐만 아니라 적절 한 증강 행동과 유전자 전사5,,89에 필요한 규정 단위는.
HOX 유전자는 배아 개발 하는 동안 중요 한 역할을 재생 하 고 그들은 일시적으로 그리고 공간 제한 됩니다 그들의 표현 패턴. HOXA 소재 시 두 안정 TADs CTCF 관련 경계 요소 hESCs 및 IMR90 셀1에 의해 앞쪽 및 후부 유전자를 분리 형성 한다. 최근 보고서는 HoxBlinc, HoxB 관련 된 로커 스 lncRNA 중재 CTCF 형성 시연 TADs와 HOXB 소재 시 상호 작용 증강/발기인 감독. 이것은 ESC 헌신과 차별화10중 앞쪽에 HOXB 유전자 활성화. 또한, 특정 유전자 loci HOXA 소재 시를 포함 하 여에 CTCF의 변경 태 드 도메인 변경 계보 특정 유전자 표현 프로필을 중재 하 고 질병 상태11,12의 개발과 관련 된 했다. 증거는 CTCF 유전자 전사를 조정 하 고 기능 도메인으로 게놈을 구성 하 여 셀 정체성 결정에 대 한 기본 기능을 지원 합니다.
조, 중 배아 개발에서의 역할에도 불구 하 고 HOX 유전자 조절 조 혈 줄기와 조상 세포 (HS/PC) 기능. 이것은 확산 및 감 별 법10,13,,1415사이의 균형을 제어 하 여 이루어집니다. HOX 유전자의 표현 사양과 HS에 가장 높은 표정으로 조 혈 모 세포의 분화를 통해 긴밀 하 게 규제 / pc HOX 유전자 발현의 최저 수준으로 성숙 하는 동안 점차 감소 조 혈 모 세포16차별에서 발생. HOX 유전자 dysregulation leukemic 전이17,18선도 HS/Pc의 dysregulating 자체 갱신 및 차별화 속성으로 leukemic 전이의 지배적인 메커니즘입니다. 그러나, 구축 및 유지 관리 관련된 규제 네트워크 HOX 유전자의 종양 식 패턴 대 정상의 기계 장치는 불분명 남아 있습니다.
CRISPR-Cas9 sgRNA 라이브러리 심사 잘으로 비-코딩 유전자, lncRNA20 와 미르21 종 등으로 단백질 코딩 유전자19 가 널리 사용 되었습니다. 그러나, 새로운 게놈 목표를 식별 하는 CRISPR-Cas9 sgRNA 라이브러리를 사용 하는 비용 때문에 높은 처리량 게놈 시퀀싱은 종종 sgRNA 라이브러리 심사 확인, 높은 남아 있습니다. 우리의 sgRNA 시스템 심사 특정 게놈 loci에 집중 하 고 HOXA9같은 마커 유전자 발현에 따라 1 단계 RT-PCR을 통해 대상 sgRNAs를 평가. 또한, 생어 시퀀싱 게놈, 및 Indel 돌연변이에 sgRNA 통합 되었다 확인 사이트를 대상으로 sgRNA를 식별 하기 위해 검색할 수 있습니다. Loci 특정 CRISPR Cas9 유전자 검사를 통해 CBS7/9 chromatin 경계 종양 chromatin 도메인을 설정 하 고 급성 골수성 백혈병의 병 인에서 소성 HOX 유전자 표현 패턴 유지를 위한 중요 한 레 귤 레이 터로 확인 되었습니다. 12. 메서드 CTCF 경계 배아 개발, 조, leukemogenesis, 뿐만 아니라 CTCF 경계에서의 특정 기능 뿐만 아니라 미래의 후 치료에 대 한 잠재적인 치료 대상으로 식별에 널리 적용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
단백질 코딩 유전자 관련 sgRNA 라이브러리 유전자와 sgRNA 농축24,,2526 통해 특정 세포 기능을 통제 하는 네트워크를 식별 하는 기능 심사 시스템에 적용 된 ,2728. 여러 비 코딩 영역 sgRNA 라이브러리 또한 표시 했다 유전자 특정 기능 화면 원심 및 인접 요소, BCL11A, 약물 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
또한 저자는 원고를 편집 하기 위해 니콜라스 Cesari를 감사 합니다. 작품은 건강의 국립 연구소 (상훈, R01DK110108, R01CA204044)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| Proteinase K | Thermo Fisher Scientific | 25530049 | |
| Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A1113802 | |
| Stbl3 cells | Life Technologies | C737303 | |
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| MOLM-13 | DSMZ | ACC 554 | |
| lentiCRISPRv2 | Addgene | 52961 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pGEM®-T Easy Vector Systems | Promega | A137A | |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| QIAquick Gel Extract kit | QIAGEN | 28706 | |
| QIAuick PCR purification kit | QIAGEN | 28106 | |
| SingleShot™ SYBR® Green One-Step Kit | Bio-Rad Laboratories | 1725095 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12163 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965084 | |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10-082-147 | |
| Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Life Technologies | 10378016 | |
| Lenti-X Concentrator | Clontech | 631232 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Polybrene | Santa Cruz Biotechnology | sc-134220 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genessee Scientific | 25-507 | |
| TAE buffer | Thermo Fisher Scientific | FERB49 | |
| Surveyor® Mutation Detection Kits | Integrated DNA Technologies | 706020 | |
| Biorad Universal Hood II Gel Doc System | Bio-Rad | 170-8126 | |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000138 | |
| Digital Dry Baths/Block Heaters | Thermo Fisher Scientific | 88870002 | |
| TSX Series Ultra-Low Freezers | Thermo Fisher Scientific | TSX40086V | |
| Forma™ Steri-Cult™ CO2 Incubators | Thermo Fisher Scientific | 3308 | |
| Herasafe™ KS, Class II Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific | 51022484 | |
| Sorvall™ Legend™ XT/XF Centrifuge Series | Thermo Fisher Scientific | 75004506 | |
| Fisherbrand™ Isotemp™ Water Baths | Thermo Fisher Scientific | FSGPD02 | |
| Thermo Scientific™ Locator™ Plus Rack and Box Systems | Thermo Fisher Scientific | 13-762-353 | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855195 | |
| MiniAmp™ Thermal Cycler | Applied Biosystems technology | A37834 | |
| Thermo Scientific™ Owl™ EC300XL2 Compact Power Supply | Thermo Fisher Scientific | 7217581 | |
| Thermo Scientific™ Owl™ EasyCast™ B1 Mini Gel Electrophoresis Systems | Thermo Fisher Scientific | 09-528-178 | |
| VWR® Tube Rotator and Rotisseries | VWR International | 10136-084 | |
| VWR® Incubating Mini Shaker | VWR International | 12620-942 | |
| Analytical Balance MS104TS/00 | METTLER TOLEDO | 30133522 | |
| DS-11 FX and DS-11 FX+ Spectrophotometer | DeNovix Inc. | DS-11 FX |
Referências
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