HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA biblioteca rastreio identificando crítico CTCF limites
Summary
Uma biblioteca CRISPR/sgRNA aplicou-se para interrogar os genes codificantes de proteínas. No entanto, a viabilidade de uma biblioteca de sgRNA para descobrir a função de um limite CTCF na regulação gênica permanece inexplorada. Aqui, descrevemos uma biblioteca de sgRNA específico de loci HOX para elucidar a função dos limites CTCF HOX loci.
Abstract
CCCTC-fator obrigatório (CTCF)-mediada estável topologicamente associando domínios (TADs) desempenham um papel crítico na restrição de interações de elementos de DNA que estão localizados na vizinha TADs. CTCF desempenha um papel importante na regulação da expressão espacial e temporal de genes HOX que controlam o desenvolvimento embrionário, modelação do corpo, hematopoiese e leukemogenesis. No entanto, permanece em grande parte desconhecido se e como HOX loci associados CTCF limites regulam a organização da cromatina e expressão dos genes HOX . No actual protocolo, foi gerada uma biblioteca em pool específico sgRNA todos os sítios de ligação CTCF os loci HOXA/B/C/D para examinar os efeitos da rompendo limites de cromatina CTCF-associado em formação TAD e gene Homeótico expressão. Através de CRISPR-Cas9 rastreio genético, o sítio de ligação do CTCF localizado entre genes HOXA7/HOXA9 (CBS7/9) foi identificado como um regulador crítico do domínio de cromatina oncogênica, bem como sendo importantes para a manutenção de uma gravidez ectópica gene HOX padrões de expressão em MLL-rearranjou a leucemia mieloide aguda (LMA). Assim, esta biblioteca sgRNA triagem abordagem fornece novos insights sobre organização de genoma CTCF mediada loci de genes específicos e também fornece uma base para a caracterização funcional dos elementos normativos genéticas anotados, ambos de codificação e não-codificante, durante processos biológicos normais na época do projeto genoma pós humano.
Introduction
Recentes estudos de interacção do genoma revelaram que os formulários do genoma nuclear humano estável domínios topologicamente associados (TADs) que são conservados entre as espécies e tipos de células. A organização do genoma em domínios separados facilita e restringe as interações entre elementos reguladores (por exemplo, potenciadores e promotores). O fator de ligação CCCTC (CTCF) liga-se aos limites do TAD e desempenha um papel crítico na restrição de interações de elementos de DNA que estão localizados na vizinha TADs1. Dados de vinculação CTCF amplo do genoma revelaram, no entanto, que embora CTCF principalmente interage com os mesmos DNA-sites em diferentes tipos de células, muitas vezes funciona como uma barreira de cromatina em um site específico no tipo de uma célula, mas não na outra, sugerindo que funções do CTCF juntamente com outras atividades na formação de cromatina limites2. O que permanece desconhecido é se os elementos de contorno (sites de ligação CTCF) estão directamente relacionados com a função biológica do CTCF e como ocorrem esses links. Portanto, nós hypothesize que sítios específicos de ligação CTCF no genoma diretamente regulam a formação de TADs e controlam interações promotor/realçador dentro desses domínios ou entre domínios vizinhos. A conclusão dos humanos e projetos de sequenciamento do genoma do rato e subsequentes análises epigenéticas ter descoberto novas assinaturas genéticas e moleculares do genoma. No entanto, o papel de assinaturas/modificações específicas na regulação gênica e função celular, bem como seu mecanismo molecular (s), ainda tem que ser completamente compreendido.
Várias linhas de evidência suportam que o TADs CTCF-mediada representam cromatina funcional domínios3,4,5. Embora CTCF principalmente interage com os mesmos DNA-sites em diferentes tipos de células, genoma ampla CTCF ChIP-seq dados revelaram que CTCF muitas vezes funciona como uma barreira de cromatina no tipo de uma célula, mas não em outros2. CTCF desempenha um papel essencial durante o desenvolvimento mediando genoma organização4,6,7. Rompimento de limites CTCF prejudicada interações realçador/promotor e expressão do gene, levando à obstrução do desenvolvimento. Isto sugere que a CTCF mediada TADs não são apenas componentes estruturais, mas também unidades regulamentares necessárias para o adequado potenciador ação e gene transcrição5,8,9.
Genes HOX desempenham papéis críticos durante o desenvolvimento embrionário, e eles são temporalmente e espacialmente restritas em seus padrões de expressão. O locus HOXA forma dois TADs estáveis separando genes anteriores e posteriores por um elemento de limite CTCF-associado em hESCs e IMR90 as células1. Relatórios recentes demonstraram que o HoxBlinc, um lncRNA de locus associado HoxB , Medeia a formação do CTCF dirigido Tad e interações realçador/promotor no locus HOXB . Isto leva à ativação do gene HOXB anterior durante ESC compromisso e diferenciação10. Além disso, em loci de genes específicos incluindo o locus HOXA , alteração do CTCF mediada TAD domínios mudados linhagem perfis de expressão de genes específicos e foi associada com o desenvolvimento da doença Estados11,12. A evidência suporta uma função primária para CTCF na coordenação da transcrição do gene e determinar a identidade da célula organizando o genoma em domínios funcionais.
Apesar de seu papel no desenvolvimento embrionário, durante a hematopoiese, genes HOX regulam a função de célula (HS/PC) de haste e progenitoras hematopoiética. Isso é feito controlando o equilíbrio entre a proliferação e diferenciação de10,13,14,15. A expressão dos genes HOX é fortemente regulamentada em toda a especificação e a diferenciação das células hematopoiéticas, com maior expressão em HS / PCs. HOX expressao diminui gradualmente durante o amadurecimento, com seus níveis mais baixos ocorrendo em diferenciados de células hematopoiéticas16. Desregulagem do gene HOX é um mecanismo dominante das transformações leucêmicas por propriedades de auto-renovação e diferenciação de dysregulating levando a transformação leucêmicas17,18HS/PCs. No entanto, o mecanismo de estabelecimento e manutenção normal vs padrões de expressão oncogênica de genes HOX , bem como redes de regulação associadas permanece obscuro.
Rastreio de biblioteca CRISPR-Cas9 sgRNA tem sido amplamente utilizado para interrogar de genes codificantes de proteínas19 como genes bem como não-codificantes, como20 e miRNA lncRNA21 em diferentes espécies. No entanto, o custo para usar a biblioteca de sgRNA CRISPR-Cas9 para identificar novos alvos genômicos permanece elevado, porque o sequenciamento do genoma do elevado-throughput é muitas vezes aplicado para verificar o rastreio de biblioteca de sgRNA. Nosso sistema de rastreio de sgRNA está focada em locus específico do genoma e avalia o direcionamento sgRNAs através de uma etapa de RT-PCR de acordo com a expressão de gene marcador, como HOXA9. Além disso, Sanger sequenciamento confirmou que o sgRNA foi integrado no genoma e mutações Indel pode ser detectado para identificar o sgRNA segmentação local. Através do rastreio genético do CRISPR-Cas9 locus específico, o limite de cromatina de CBS7/9 foi identificado como um regulador fundamental para estabelecer o domínio de cromatina oncogênicos e manter padrões de expressão de gene HOX ectópica na patogênese da LMA 12. o método pode ser amplamente aplicado para identificar não somente a função específica de limite CTCF no desenvolvimento embrionário, a hematopoiese, leukemogenesis, mas também limite CTCF como alvos terapêuticos para futura terapia epigenética.
Protocol
Representative Results
Discussion
Genes codificantes de proteínas relacionadas com bibliotecas de sgRNA foram aplicadas em um sistema funcional de triagem para identificação de genes e redes, regulação de funções celulares específicas através de sgRNA enriquecimento24,25,26 ,de27,28. Região não-codificante vários relacionados com bibliotecas de sgRNA também foram mostradas em tel…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores também agradecer Nicholas Cesari para editar o manuscrito. O trabalho foi apoiado por concessões do Instituto Nacional de saúde (S.H., R01DK110108, R01CA204044).
Materials
| Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| Proteinase K | Thermo Fisher Scientific | 25530049 | |
| Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A1113802 | |
| Stbl3 cells | Life Technologies | C737303 | |
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| MOLM-13 | DSMZ | ACC 554 | |
| lentiCRISPRv2 | Addgene | 52961 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pGEM®-T Easy Vector Systems | Promega | A137A | |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| QIAquick Gel Extract kit | QIAGEN | 28706 | |
| QIAuick PCR purification kit | QIAGEN | 28106 | |
| SingleShot™ SYBR® Green One-Step Kit | Bio-Rad Laboratories | 1725095 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12163 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965084 | |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10-082-147 | |
| Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Life Technologies | 10378016 | |
| Lenti-X Concentrator | Clontech | 631232 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Polybrene | Santa Cruz Biotechnology | sc-134220 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genessee Scientific | 25-507 | |
| TAE buffer | Thermo Fisher Scientific | FERB49 | |
| Surveyor® Mutation Detection Kits | Integrated DNA Technologies | 706020 | |
| Biorad Universal Hood II Gel Doc System | Bio-Rad | 170-8126 | |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000138 | |
| Digital Dry Baths/Block Heaters | Thermo Fisher Scientific | 88870002 | |
| TSX Series Ultra-Low Freezers | Thermo Fisher Scientific | TSX40086V | |
| Forma™ Steri-Cult™ CO2 Incubators | Thermo Fisher Scientific | 3308 | |
| Herasafe™ KS, Class II Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific | 51022484 | |
| Sorvall™ Legend™ XT/XF Centrifuge Series | Thermo Fisher Scientific | 75004506 | |
| Fisherbrand™ Isotemp™ Water Baths | Thermo Fisher Scientific | FSGPD02 | |
| Thermo Scientific™ Locator™ Plus Rack and Box Systems | Thermo Fisher Scientific | 13-762-353 | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855195 | |
| MiniAmp™ Thermal Cycler | Applied Biosystems technology | A37834 | |
| Thermo Scientific™ Owl™ EC300XL2 Compact Power Supply | Thermo Fisher Scientific | 7217581 | |
| Thermo Scientific™ Owl™ EasyCast™ B1 Mini Gel Electrophoresis Systems | Thermo Fisher Scientific | 09-528-178 | |
| VWR® Tube Rotator and Rotisseries | VWR International | 10136-084 | |
| VWR® Incubating Mini Shaker | VWR International | 12620-942 | |
| Analytical Balance MS104TS/00 | METTLER TOLEDO | 30133522 | |
| DS-11 FX and DS-11 FX+ Spectrophotometer | DeNovix Inc. | DS-11 FX |
Referências
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