HOX Loci fokus CRISPR/sgRNA bibliotek Screening at identificere kritiske CTCF grænser
Summary
En CRISPR/sgRNA bibliotek er blevet anvendt til spørgekriterierne protein-kodning gener. Dog stadig gennemførligheden af et sgRNA bibliotek til at afsløre funktionen af en CTCF grænse RIBOREGULATION uudforsket. Her beskriver vi et HOX loci specifikke sgRNA bibliotek for at klarlægge funktionen af CTCF grænser i HOX loci.
Abstract
CCCTC-bindende faktor (CTCF)-medieret stabil topologisk knytte domæner (TADs) spiller en afgørende rolle i Begrænsningsfacetten vekselvirkninger mellem DNA elementer, der er placeret i nabolandet TADs. CTCF spiller en vigtig rolle i reguleringen af den rumlige og tidsmæssige udtryk for HOX gener, der styrer embryonale udvikling, krop mønstre, bloddannelsen og årsager. Det er imidlertid stort set ukendt, om og hvordan HOX loci forbundet CTCF grænser regulere kromatin organisation og HOX genekspression. I den nuværende protokol, er en bestemt sgRNA poolede bibliotek rettet mod alle CTCF bindingssteder i HOXA/B/C/D loci genereret for at undersøge virkningerne af forstyrre CTCF-associerede kromatin grænser på TAD dannelse og HOX gen udtryk. Gennem CRISPR-Cas9 er genetisk screening, CTCF bindingssted ligger mellem HOXA7/HOXA9 gener (CBS7/9) blevet identificeret som en kritisk regulator af muterede kromatin domæne, samt at være vigtige for at opretholde ektopisk HOX gen udtrykket mønstre i MLL-omarrangeret akut myeloid leukæmi (AML). Således, denne sgRNA bibliotek screening tilgang giver ny indsigt i CTCF medieret genom organisation i bestemte gen loci og giver også et grundlag for den funktionelle karakterisering af de kommenterede genetiske regulerende elementer, begge kodning og Noncoding, under normale biologiske processer i den post-menneskelige genom-projektet æra.
Introduction
Nylige genom interaktion undersøgelser afslørede, at de menneskelige nukleare genom former stabil topologisk sætter domæner (TADs), der er bevaret på tværs af celletyper og arter. Organisation af genomet i separate domæner letter og begrænser interaktioner mellem regulerende elementer (fx smagsforstærkere og promotorer). CCCTC-bindende faktor (CTCF) bindes til TAD grænser og spiller en afgørende rolle i Begrænsningsfacetten vekselvirkninger mellem DNA elementer, der er placeret i nærliggende TADs1. Genom bred CTCF bindende data viste imidlertid, at selv om CTCF for det meste interagerer med de samme DNA-sites i forskellige celletyper, det ofte fungerer som en kromatin barriere på en bestemt lokalitet i én celletype, men ikke i den anden, hvilket tyder på at CTCF funktioner sammen med andre aktiviteter i dannelsen af kromatin grænser2. Hvad forbliver ukendt er om grænsen elementer (CTCF-bindingssteder) er direkte knyttet til den biologiske funktion af CTCF, og hvordan disse links forekommer. Derfor, vi hypotesen om, at specifikke CTCF bindingssteder i genomet direkte regulerer dannelsen af TADs og styre promotor/forstærker interaktioner i disse domæner eller mellem tilstødende domæner. Færdiggørelsen af de menneskelige og mus genome sequencing projekter og efterfølgende epigenetiske analyser har afsløret nye molekylære og genetiske signaturer af genomet. Men rollen som særlige signaturer/ændringer i genregulering samt cellefunktion og deres molekylære mekanismer, har endnu at være fuldt forstået.
Flere linjer af beviser støtter, at en CTCF-medieret TADs repræsenterer funktionel kromatin domæner3,4,5. Selv om CTCF for det meste interagerer med de samme DNA-sites i forskellige celletyper, viste genom bred CTCF ChIP-seq data, at CTCF ofte fungerer som kromatin barriere i én celletype, men ikke i de andre2. CTCF spiller en væsentlig rolle i udviklingen af mægle genom organisation4,6,7. Afbrydelse af CTCF grænser nedsat forstærker/promotor interaktioner og genekspression, fører til udviklingsmæssige blokering. Dette tyder på, at CTCF medieret TADs er ikke kun strukturelle komponenter, men også administrative enheder kræves for korrekt enhancer handling og gen transskription5,8,9.
HOX gener spiller en kritisk rolle i løbet af fosterudviklingen, og de er tidsmæssigt og rumligt begrænsede i deres udtryk mønstre. HOXA locus danner to stabile TADs adskille anteriore og posteriore gener af en CTCF-associerede grænse element i både hESCs og IMR90 celler1. De seneste rapporter viste, at HoxBlinc, en HoxB locus forbundet lncRNA, medierer dannelsen af CTCF instrueret TADs og forstærker/promotor interaktioner i HOXB locus. Dette fører til forreste HOXB genaktivering under ESC engagement og differentiering10. Desuden på bestemte gen loci herunder HOXA locus, ændring af CTCF medieret TAD domæner ændret lineage bestemt gen expression profiler og var forbundet med udvikling af sygdom stater11,12. Beviser understøtter en primær funktion for CTCF i koordinere gen transskription og bestemmelse af celle identitet ved at organisere genomet i funktionelle domæner.
Trods sin rolle i den embryonale udvikling, under bloddannelsen, regulere HOX gener hæmatopoietisk stilk og stamfader celle (HS/PC) funktion. Dette gøres ved at styre balancen mellem spredning og differentiering10,13,14,15. Udtryk af gener, HOX er stramt reguleret i hele specifikation og differentiering af hæmatopoietisk celler med højeste udtryk i HS / pc’er. HOX genekspression aftager gradvist under modning, med dens laveste niveauer forekommende i opdelte hæmatopoietisk celler16. HOX gen dysregulering er en dominerende mekanisme leukemic transformation af dysregulating selvfornyelse og differentiering egenskaber af HS/pc’er fører til leukemic transformation17,18. Men mekanismen for etablering og vedligeholdelse af normal vs. muterede udtryk mønstre af HOX gener samt tilknyttede regulerende net uklart.
CRISPR-Cas9 sgRNA bibliotek screening har været meget anvendt til at afhøre protein-kodning gener19 som godt ikke-kodende gener, som lncRNA20 og miRNA21 i forskellige arter. Men omkostningerne til at bruge biblioteket CRISPR-Cas9 sgRNA til at identificere nye genomisk mål forbliver høj, fordi høj overførselshastighed genome sequencing er ofte anvendt til at kontrollere sgRNA bibliotek screening. Vores sgRNA screening system er fokuseret på specifikke genom loci og evaluerer den målretning sgRNAs gennem et-trins RT-PCR ifølge markør Gen-ekspression, såsom HOXA9. Derudover kan Sanger sekventering bekræftet, at sgRNA var integreret i genomet, og Indel mutationer påvises for at identificere sgRNA målretning site. Gennem loci-specifikke CRISPR-Cas9 genetisk screening, er CBS7/9 kromatin grænse blevet identificeret som en kritisk regulator for oprettelse af muterede kromatin domæne og vedligeholde ektopisk HOX gen expression mønstre i AML patogenese 12. metoden kan anvendes bredt til at identificere ikke kun specifikke funktion af CTCF grænse i fosterudviklingen, bloddannelsen, årsager, men også CTCF grænse som potentielle terapeutiske mål for fremtidige epigenetiske terapi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protein-kodning gen relateret sgRNA biblioteker har været anvendt i en funktionel screening system til identifikation af gener og regulering af specifikke cellulære funktioner gennem sgRNA berigelse24,25,26 -netværk ,27,28. Flere ikke-kodende region relateret sgRNA biblioteker blev også vist i gen-specifikke funktionelle skærme til distale og proksimale …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne også takke Nicholas Cesari redigeringsværktøjer håndskriftet. Arbejdet blev støttet af tilskud fra National Institute of Health (S.H., R01DK110108, R01CA204044).
Materials
| Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| Proteinase K | Thermo Fisher Scientific | 25530049 | |
| Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A1113802 | |
| Stbl3 cells | Life Technologies | C737303 | |
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| MOLM-13 | DSMZ | ACC 554 | |
| lentiCRISPRv2 | Addgene | 52961 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pGEM®-T Easy Vector Systems | Promega | A137A | |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| QIAquick Gel Extract kit | QIAGEN | 28706 | |
| QIAuick PCR purification kit | QIAGEN | 28106 | |
| SingleShot™ SYBR® Green One-Step Kit | Bio-Rad Laboratories | 1725095 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12163 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965084 | |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10-082-147 | |
| Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Life Technologies | 10378016 | |
| Lenti-X Concentrator | Clontech | 631232 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Polybrene | Santa Cruz Biotechnology | sc-134220 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genessee Scientific | 25-507 | |
| TAE buffer | Thermo Fisher Scientific | FERB49 | |
| Surveyor® Mutation Detection Kits | Integrated DNA Technologies | 706020 | |
| Biorad Universal Hood II Gel Doc System | Bio-Rad | 170-8126 | |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000138 | |
| Digital Dry Baths/Block Heaters | Thermo Fisher Scientific | 88870002 | |
| TSX Series Ultra-Low Freezers | Thermo Fisher Scientific | TSX40086V | |
| Forma™ Steri-Cult™ CO2 Incubators | Thermo Fisher Scientific | 3308 | |
| Herasafe™ KS, Class II Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific | 51022484 | |
| Sorvall™ Legend™ XT/XF Centrifuge Series | Thermo Fisher Scientific | 75004506 | |
| Fisherbrand™ Isotemp™ Water Baths | Thermo Fisher Scientific | FSGPD02 | |
| Thermo Scientific™ Locator™ Plus Rack and Box Systems | Thermo Fisher Scientific | 13-762-353 | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855195 | |
| MiniAmp™ Thermal Cycler | Applied Biosystems technology | A37834 | |
| Thermo Scientific™ Owl™ EC300XL2 Compact Power Supply | Thermo Fisher Scientific | 7217581 | |
| Thermo Scientific™ Owl™ EasyCast™ B1 Mini Gel Electrophoresis Systems | Thermo Fisher Scientific | 09-528-178 | |
| VWR® Tube Rotator and Rotisseries | VWR International | 10136-084 | |
| VWR® Incubating Mini Shaker | VWR International | 12620-942 | |
| Analytical Balance MS104TS/00 | METTLER TOLEDO | 30133522 | |
| DS-11 FX and DS-11 FX+ Spectrophotometer | DeNovix Inc. | DS-11 FX |
Referências
- Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
- Cuddapah, S., et al. Global analysis of the insulator binding protein CTCF in chromatin barrier regions reveals demarcation of active and repressive domains. Genome research. 19 (1), 24-32 (2009).
- Phillips, J. E., Corces, V. G. CTCF: master weaver of the genome. Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).
- Tang, Z., et al. CTCF-Mediated Human 3D Genome Architecture Reveals Chromatin Topology for Transcription. Cell. 163 (7), 1611-1627 (2015).
- Lupianez, D. G., et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 161 (5), 1012-1025 (2015).
- Dowen, J. M., et al. Control of cell identity genes occurs in insulated neighborhoods in mammalian chromosomes. Cell. 159 (2), 374-387 (2014).
- Phillips-Cremins, J. E., et al. Architectural protein subclasses shape 3D organization of genomes during lineage commitment. Cell. 153 (6), 1281-1295 (2013).
- Narendra, V., Bulajic, M., Dekker, J., Mazzoni, E. O., Reinberg, D. CTCF-mediated topological boundaries during development foster appropriate gene regulation. Genes & Development. 30 (24), 2657-2662 (2016).
- Narendra, V., et al. CTCF establishes discrete functional chromatin domains at the Hox clusters during differentiation. Science. 347 (6225), 1017-1021 (2015).
- Deng, C., et al. HoxBlinc RNA Recruits Set1/MLL Complexes to Activate Hox Gene Expression Patterns and Mesoderm Lineage Development. Cell Reports. 14 (1), 103-114 (2016).
- Patel, B., et al. Aberrant TAL1 activation is mediated by an interchromosomal interaction in human T-cell acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 28 (2), 349-361 (2014).
- Luo, H., et al. CTCF boundary remodels chromatin domain and drives aberrant HOX gene transcription in acute myeloid leukemia. Blood. 132 (8), 837-848 (2018).
- Dou, D. R., et al. Medial HOXA genes demarcate haematopoietic stem cell fate during human development. Nature Cell Biology. 18 (6), 595-606 (2016).
- Lawrence, H. J., et al. Loss of expression of the Hoxa-9 homeobox gene impairs the proliferation and repopulating ability of hematopoietic stem cells. Blood. 106 (12), 3988-3994 (2005).
- Deng, C., et al. USF1 and hSET1A mediated epigenetic modifications regulate lineage differentiation and HoxB4 transcription. PLOS Genetics. 9 (6), e1003524 (2013).
- Rawat, V. P., Humphries, R. K., Buske, C. Beyond Hox: the role of ParaHox genes in normal and malignant hematopoiesis. Blood. 120 (3), 519-527 (2012).
- Alharbi, R. A., Pettengell, R., Pandha, H. S., Morgan, R. The role of HOX genes in normal hematopoiesis and acute leukemia. Leukemia. 27 (5), 1000-1008 (2013).
- Rice, K. L., Licht, J. D. HOX deregulation in acute myeloid leukemia. Journal of Clinical Investigation. 117 (4), 865-868 (2007).
- Bassett, A. R., Kong, L., Liu, J. L. A genome-wide CRISPR library for high-throughput genetic screening in Drosophila cells. Journal of Genetics and Genomics. 42 (6), 301-309 (2015).
- Zhu, S., et al. Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library. Nature Biotechnology. 34 (12), 1279-1286 (2016).
- Kurata, J. S., Lin, R. J. MicroRNA-focused CRISPR-Cas9 library screen reveals fitness-associated miRNAs. RNA. 24 (7), 966-981 (2018).
- Collins, C. T., Hess, J. L. Role of HOXA9 in leukemia: dysregulation, cofactors and essential targets. Oncogene. 35 (9), 1090-1098 (2016).
- Kroon, E., Thorsteinsdottir, U., Mayotte, N., Nakamura, T., Sauvageau, G. NUP98-HOXA9 expression in hemopoietic stem cells induces chronic and acute myeloid leukemias in mice. The EMBO Journal. 20 (3), 350-361 (2001).
- Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. P., Velasco-Herrera Mdel, C., Yusa, K. Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library. Nature Biotechnology. 32 (3), 267-273 (2014).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
- Zhou, J., et al. Dual sgRNAs facilitate CRISPR/Cas9-mediated mouse genome targeting. The FEBS Journal. 281 (7), 1717-1725 (2014).
- Sanjana, N. E., et al. High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome. Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).
- Rajagopal, N., et al. High-throughput mapping of regulatory DNA. Nature Biotechnology. 34 (2), 167-174 (2016).
- Korkmaz, G., et al. Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 192-198 (2016).
- Rezaei, N., et al. FMS-Like Tyrosine Kinase 3 (FLT3) and Nucleophosmin 1 (NPM1) in Iranian Adult Acute Myeloid Leukemia Patients with Normal Karyotypes: Mutation Status and Clinical and Laboratory Characteristics. Turkish Journal of Haematology. 34 (4), 300-306 (2017).
- Yaragatti, M., Basilico, C., Dailey, L. Identification of active transcriptional regulatory modules by the functional assay of DNA from nucleosome-free regions. Genome Research. 18 (6), 930-938 (2008).
- Wilken, M. S., et al. DNase I hypersensitivity analysis of the mouse brain and retina identifies region-specific regulatory elements. Epigenetics Chromatin. 8, 8 (2015).
- Narlikar, L., Ovcharenko, I. Identifying regulatory elements in eukaryotic genomes. Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 8 (4), 215-230 (2009).
- Hnisz, D., et al. Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods. Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).
