In vitro Ubiqitinering og Deubiquitination analyser av Nucleosomal Histoner
Summary
Ubiqitinering er en post-translational modifikasjon som spiller viktige roller i cellulære prosesser og er tett koordinert av deubiquitination. Defekter i begge reaksjonene ligger til grunn menneskelige patologi. Vi tilbyr protokoller for å gjennomføre ubiqitinering og deubiquitination reaksjon in vitro ved hjelp av renset komponenter.
Abstract
Ubiqitinering er en post-translational modifikasjon som spiller viktige roller i ulike signalering veier og er spesielt involvert i samordning av kromatin funksjon og DNA-assosiert prosesser. Denne endringen innebærer en sekvensiell handling av flere enzymer inkludert E1 ubiquitin-aktivering, E2 ubiquitin-bøye og E3 ubiquitin-ligase og reverseres av deubiquitinases (DUBs). Ubiqitinering induserer degradering av proteiner eller endring av protein funksjon inkludert modulering av enzymatisk aktivitet, protein-protein interaksjon og subcellulære lokalisering. Et kritisk skritt i å demonstrere protein ubiqitinering eller deubiquitination er å utføre in vitro reaksjoner med renset komponenter. Effektive ubiqitinering og deubiquitination reaksjoner kan bli sterkt påvirket av de ulike komponentene som brukes, enzym co-faktorer, buffer forhold, og arten av underlaget. Her gir vi trinn-for-trinn protokoller for å gjennomføre ubiqitinering og deubiquitination reaksjoner. Vi illustrerer disse reaksjonene ved hjelp av minimale komponenter av musen Polycomb undertrykkende Complex 1 (PRC1), BMI1, og RING1B, en E3 ubiquitin ligase som monoubiquitinates histone H2A på lysin 119. Deubiquitination av nucleosomal H2A utføres ved hjelp av en minimal Polycomb undertrykkende Deubiquitinase (PR-DUB) kompleks dannet av den menneskelige Deubiquitinase BAP1 og DEUBiquitinase adapter (DEUBAD) domenet til co-Factor ASXL2. Disse ubiqitinering/deubiquitination analysene kan gjennomføres i sammenheng med enten rekombinant nucleosomes tilberedt med bakterier-renset proteiner eller innfødte nucleosomes renset fra pattedyrceller. Vi fremhever vanskelighetene som kan ha en betydelig innvirkning på disse reaksjonene, og vi foreslår at de generelle prinsippene for disse protokollene raskt kan tilpasses andre E3-ubiquitin ligases og deubiquitinases.
Introduction
Ubiqitinering er en av de mest bevarte post-translational modifikasjoner og er avgjørende for et bredt spekter av organismer, inkludert gjær, planter og virveldyr. Ubiqitinering består av kovalente feste av ubiquitin, en svært bevart 76 aminosyre polypeptid, å målrette proteiner og forekommer i tre sekvensielle trinn som involverer tre enzymer, dvs., E1-aktivering, E2-bøye og E3 ligase1, 2,3. Dette post-translational modifikasjon spiller sentrale roller i et bredt spekter av biologiske prosesser. Faktisk er E3 ligases, som gir spesifisitet av reaksjonen, utgjør en stor overfamilie av enzymer og er de mest tallrike enzymer i ubiquitin system4,5,6. Den nedstrøms effekten av protein ubiqitinering avhenger av innholdet i endringen: monoubiquitination, multi-monoubiquitination, og lineær eller utvidet polyubiquitination. Monoubiquitination er sjelden forbundet med proteasomal degradering, men i stedet denne endringen er involvert i formidling ulike signalnettverk hendelser. Polyubiquitination involverer N-Terminal eller lysin rester i ubiquitin molekyl selv, og skjebnen til en polyubiquitinated protein avhenger av hvilke rester er involvert i ubiquitin kjeden forlengelse. Det har lenge vært kjent at polyubiquitination formidlet av lysin 48 av ubiquitin induserer proteasomal degradering. Tvert imot, polyubiquitination via lysin 63 av ubiquitin er ofte forbundet med protein aktivisering7,8,9. I likhet med andre viktige post-translational modifikasjoner, ubiqitinering er reversibel og ubiquitin fjerning av proteiner er sikret ved spesifikk proteaser betegnes deubiquitinases (DUBs), som har dukket opp som viktige regulatorer av cellulære prosesser 2 andre priser , 10. viktigere, mange DUBs er høyt spesialiserte, og regulerer gjennom deubiquitination, spesifikke underlag, noe som indikerer at en fin balanse mellom ubiqitinering og deubiquitination er kritisk for protein funksjon. E3s og DUBs, sammen med proteasomet ned brytnings maskiner og tilbehørs faktorer, danner Ubiquitin Proteasomet system (UPS, med > 1200 gener) som regulerer store signal veier, hvorav flere er forbundet med cellevekst og spredning, celle skjebne besluttsomhet, differensiering, celle migrasjon, og celle død. Viktigere, dereguleringen av flere signalering kaskader involverer ubiqitinering fremmer tumorigenesis og neurodegeneration sykdommer5,11,12,13, 14i det.
Ubiqitinering spiller gjennomgripende roller i kromatin biologi og DNA-avhengige prosesser15,16,17. For eksempel, monoubiquitination av histone H2A på lysin 119 (heretter H2A K119ub) er en kritisk post-translational modifikasjon involvert i transcriptional undertrykkelse og DNA reparasjon18,19,20, 21,22. H2A K119ub er katalysert av Polycomb undertrykkende Complex 1 (PRC1), som spiller en nøkkelrolle i opprettholdelsen av epigenetic informasjon og er svært bevart fra Drosophila til mennesker. Kanonisk PRC1 er konstituert spesielt av RING1B og BMI1, som er kjernen E3 ubiquitin ligase kompleks ansvarlig for ovennevnte ubiqitinering hendelse22,23. I Drosophila, H2A MONOUBIQUITINATION (H2A K118ub som tilsvarer H2A K119ub i mammalians) er reversert av dub Calypso, som samhandler med ytterligere sex kam (ASX) danner Polycomb-undertrykkende dub (pr-DUB) kompleks24. Pattedyr ortholog av Calypso, BAP1, er en svulst Suppressor slettet eller deaktivert i ulike menneskelige ondartet25,26,27,28, 29 flere , 30 priser og , 31 andre , 32 for alle , 33. BAP1 regulerer DNA-avhengige prosesser i kjernen og kalsium-signalering-mediert apoptose på endoplasmatiske retikulum33,34,35,36, 37 for alle , 38 for alle , 39 for alle , 40 for alle , 41 for alle , 42. BAP1 samler multi-delenhet protein komplekser inneholder transkripsjon regulatorer spesielt ASXL1, ASXL2 og ASXL3 (ASXLs), tre orthologues av ASX38,43. ASXLs bruke DEUBiquitinase adapter (DEUBAD) domene, også kalt ASXM domene, for å stimulere BAP1 dub aktivitet35,36,44. Derfor ASXLs spille viktige roller i å koordinere BAP1 DUB aktivitet på kromatin og mer generelt sin tumor Suppressor funksjon.
Det finnes flere metoder for å studere ubiqitinering og deubiquitination prosesser. Biokjemiske analyser som bruker proteiner renset fra bakterier er fortsatt svært kraftige i å demonstrere direkte ubiqitinering av, eller fjerning av ubiquitin fra, spesifikke underlag. Disse eksperimentene kan gjennomføres for å undersøke en rekke parametre som å bestemme kravet om minimale komplekser, bestemme reaksjoner Kinetics, definere struktur/funksjon relasjoner, og forstå virkningen av patologisk genmutasjoner. Her gir vi protokoller for å gjennomføre ubiqitinering og deubiquitination reaksjoner på kromatin underlag med renset komponenter. Som et modell system, in vitro ubiqitinering og deubiquitination av nucleosomal H2A protein er presentert. Bakterier-renset proteiner montert i minimale komplekser av RING1B/BMI1 og BAP1/DEUBAD brukes for ubiqitinering eller deubiquitination av nucleosomal H2A, henholdsvis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det er flere fordeler ved å etablere robuste in vitro ubiqitinering og deubiquitination analyser for proteiner av interesse. Disse analysene kan brukes til å: (i) etablere optimale forhold og definere minimale krav til disse reaksjonene, (II) bestemme enzymatisk kinetisk og biokjemiske konstanter, (III) definere rollene til kofaktorer eller hemmere som kan påvirke disse reaksjonene, (IV) identifisere interaksjon grensesnitt, (v) teste effekten av kunstige eller sykdom-tilknyttede mutasjoner og (vi) etablere analysen f…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Diana Adjaoud for teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Natural Sciences og engineering Research Council of Canada (2015-2020), Genova Quebec (2016-2019) og Genova Canada (2016-2019) til E.B.A. E.B.A. er seniorforsker i fonds de la Recherche du Québec-santé (FRQ-S). L. M og N.S.K. har et doktorgradsstipend fra FRQ-S. H. B hadde et doktorgradsstipend fra departementet for høyere utdanning og fra Scientific Research i Tunisia og Cole Foundation.
Materials
| Amylose agarose beads | New England Biolabs | #E8021 | |
| Amicon Ultra 0.5 ml centrifugal filters 10K | Sigma-Aldrich | #UFC501096 | |
| Anti-H2AK119ub (H2Aub) | Cell Signaling Technology | #8240 | |
| Anti-Flag-agarose beads | Sigma-Aldrich | #A4596 | |
| Anti-protease cocktail | Sigma-Aldrich | #P8340 | |
| BL21 (DE3) CodonPlus-RIL bacteria | Agilent technologies | #230240 | |
| DMEM | Wisent | #319-005-CL | |
| Empty chromatography column | Biorad | #731-1550 | |
| Flag peptide | Sigma-Aldrich | #F3290 | |
| GSH-agarose beads | Sigma-Aldrich | #G4510 | |
| HEK293T | ATCC | #CRL-3216 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | #I5513 | |
| Micrococcal nuclease (MNase) | Sigma-Aldrich | #N3755 | |
| Ni-NTA agarose beads | ThermoFisher Scientific | #88221 | |
| N-methylmaleimide (NEM) | Bioshop | #ETM222 | |
| Pore syringe filter 0.45 μm | Sarstedt | #83.1826 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences Inc | #23966-1 | |
| pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109) | Addgene | #63139 | |
| Ub Activating Enzyme (UBE1) | Boston Biochem | #E-305 | |
| UBCH5C (UBE2D3) | Boston Biochem | #E2-627 |
Referências
- Ye, Y., Rape, M. Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 755-764 (2009).
- Komander, D., Clague, M. J., Urbe, S. Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 550-563 (2009).
- Ciechanover, A. The unravelling of the ubiquitin system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, 322-324 (2015).
- Nakayama, K. I., Nakayama, K. Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer. Nature Reviews Cancer. 6, 369-381 (2006).
- Senft, D., Qi, J., Ronai, Z. A. Ubiquitin ligases in oncogenic transformation and cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 18, 69-88 (2018).
- Zheng, N., Shabek, N. Ubiquitin Ligases: Structure, Function, and Regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).
- Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. Linear ubiquitin chains. NF-kappaB signalling, cell death and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, 503-508 (2014).
- Kulathu, Y., Komander, D. Atypical ubiquitylation – the unexplored world of polyubiquitin beyond Lys48 and Lys63 linkages. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13, 508-523 (2012).
- Yau, R., Rape, M. The increasing complexity of the ubiquitin code. Nature Cell Biology. 18, 579-586 (2016).
- Mevissen, T. E. T., Komander, D. Mechanisms of Deubiquitinase Specificity and Regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 159-192 (2017).
- Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 29-46 (2011).
- Minton, K. Inflammasomes: Ubiquitin lines up for inflammasome activity. Nature Reviews Immunology. 14, 580-581 (2014).
- Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20, 1242-1253 (2014).
- Upadhyay, A., Amanullah, A., Chhangani, D., Mishra, R., Mishra, A. Selective multifaceted E3 ubiquitin ligases barricade extreme defense: Potential therapeutic targets for neurodegeneration and ageing. Ageing Research Reviews. 24, 138-159 (2015).
- Hammond-Martel, I., Yu, H., Affar el, B. Roles of ubiquitin signaling in transcription regulation. Cellular Signalling. 24, 410-421 (2012).
- Schwertman, P., Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Regulation of DNA double-strand break repair by ubiquitin and ubiquitin-like modifiers. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 379-394 (2016).
- Uckelmann, M., Sixma, T. K. Histone ubiquitination in the DNA damage response. DNA Repair. 56, 92-101 (2017).
- Robzyk, K., Recht, J., Osley, M. A. Rad6-dependent ubiquitination of histone H2B in yeast. Science. 287, 501-504 (2000).
- Hwang, W. W., et al. A conserved RING finger protein required for histone H2B monoubiquitination and cell size control. Molecular Cell. 11, 261-266 (2003).
- Kim, J., Hake, S. B., Roeder, R. G. The human homolog of yeast BRE1 functions as a transcriptional coactivator through direct activator interactions. Molecular Cell. 20, 759-770 (2005).
- Wood, A., et al. an E3 ubiquitin ligase required for recruitment and substrate selection of Rad6 at a promoter. Molecular Cell. 11, 267-274 (2003).
- Wang, H., et al. Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing. Nature. 431, 873-878 (2004).
- Buchwald, G., et al. Structure and E3-ligase activity of the Ring-Ring complex of polycomb proteins Bmi1 and Ring1B. The EMBO Journal. 25, 2465-2474 (2006).
- Scheuermann, J. C., et al. Histone H2A deubiquitinase activity of the Polycomb repressive complex PR-DUB. Nature. 465, 243-247 (2010).
- Jensen, D. E., et al. BAP1: a novel ubiquitin hydrolase which binds to the BRCA1 RING finger and enhances BRCA1-mediated cell growth suppression. Oncogene. 16, 1097-1112 (1998).
- Harbour, J. W., et al. Frequent mutation of BAP1 in metastasizing uveal melanomas. Science. 330, 1410-1413 (2010).
- Abdel-Rahman, M. H., et al. GermLine BAP1 mutation predisposes to uveal melanoma, lung adenocarcinoma, meningioma, and other cancers. Journal of Medical Genetics. , (2011).
- Bott, M., et al. The nuclear deubiquitinase BAP1 is commonly inactivated by somatic mutations and 3p21.1 losses in malignant pleural mesothelioma. Nature Genetics. 43, 668-672 (2011).
- Goldstein, A. M. GermLine BAP1 mutations and tumor susceptibility. Nature Genetics. 43, 925-926 (2011).
- Testa, J. R., et al. GermLine BAP1 mutations predispose to malignant mesothelioma. Nature Genetics. 43, 1022-1025 (2011).
- Wiesner, T., et al. GermLine mutations in BAP1 predispose to melanocytic tumors. Nature Genetics. 43, 1018-1021 (2011).
- Dey, A., et al. Loss of the tumor suppressor BAP1 causes myeloid transformation. Science. 337, 1541-1546 (2012).
- Pena-Llopis, S., et al. BAP1 loss defines a new class of renal cell carcinoma. Nature Genetics. 44, 751-759 (2012).
- Bononi, A., et al. BAP1 regulates IP3R3-mediated Ca2+ flux to mitochondria suppressing cell transformation. Nature. 546, 549-553 (2017).
- Daou, S., et al. Monoubiquitination of ASXLs controls the deubiquitinase activity of the tumor suppressor BAP1. Nature Communications. 9, 4385 (2018).
- Daou, S., et al. The BAP1/ASXL2 Histone H2A Deubiquitinase Complex Regulates Cell Proliferation and Is Disrupted in Cancer. The Journal of Biological Chemistry. 290, 28643-28663 (2015).
- Mashtalir, N., et al. Autodeubiquitination protects the tumor suppressor BAP1 from cytoplasmic sequestration mediated by the atypical ubiquitin ligase UBE2O. Molecular Cell. 54, 392-406 (2014).
- Yu, H., et al. The ubiquitin carboxyl hydrolase BAP1 forms a ternary complex with YY1 and HCF-1 and is a critical regulator of gene expression. Molecular and Cellular Biology. 30, 5071-5085 (2010).
- Yu, H., et al. Tumor suppressor and deubiquitinase BAP1 promotes DNA double-strand break repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 285-290 (2014).
- Dai, F., et al. BAP1 inhibits the ER stress gene regulatory network and modulates metabolic stress response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 3192-3197 (2017).
- Zhang, Y., et al. BAP1 links metabolic regulation of ferroptosis to tumour suppression. Nature Cell Biology. 20, 1181-1192 (2018).
- Kolluri, K. K., et al. Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells. eLife. 7, (2018).
- Machida, Y. J., Machida, Y., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Dutta, A. The deubiquitinating enzyme BAP1 regulates cell growth via interaction with HCF-1. The Journal of Biological Chemistry. , (2009).
- Sahtoe, D. D., van Dijk, W. J., Ekkebus, R., Ovaa, H., Sixma, T. K. BAP1/ASXL1 recruitment and activation for H2A deubiquitination. Nature Communications. 7, 10292 (2016).
