In vitro Ubiquitination och Deubiquitination assays av Nukleosomala Histones
Summary
Ubiquitination är en post-translationella modifiering som spelar viktiga roller i cellulära processer och är tätt koordinerad av deubiquitination. Defekter i båda reaktionerna ligger bakom mänskliga patologier. Vi tillhandahåller protokoll för att utföra ubiquitination och deubiquitination reaktion in vitro med hjälp av renade komponenter.
Abstract
Ubiquitination är en post-translationella modifiering som spelar viktiga roller i olika signalering vägar och är särskilt involverad i samordningen av kromatin funktion och DNA-associerade processer. Denna modifiering innebär en sekventiell åtgärd av flera enzymer, inklusive E1 ubiquitin-aktivering, E2 ubiquitin-konjugering och E3 ubiquitin-Ligase och reverseras av deubiquitinases (DUBs). Ubiquitination inducerar nedbrytning av proteiner eller förändring av proteinfunktion inklusive modulering av enzymatisk aktivitet, protein-protein interaktion och subcellulär lokalisering. Ett kritiskt steg för att demonstrera protein ubiquitination eller deubiquitination är att utföra in vitro-reaktioner med renade komponenter. Effektiva ubiquitination och deubiquitination reaktioner kan påverkas kraftigt av de olika komponenter som används, enzym co-faktorer, buffertförhållanden, och arten av substratet. Här, vi tillhandahåller steg-för-steg-protokoll för att utföra ubiquitination och deubiquitination reaktioner. Vi illustrerar dessa reaktioner med minimala komponenter i mus polycomb repressiva Complex 1 (PRC1), BMI1, och RING1B, en E3 ubiquitin Ligase som monoubiquitinates Histon H2A på lysin 119. Deubiquitination av nucleosomal H2A utförs med hjälp av en minimal Polycomb repressiv Deubiquitinase (PR-DUB) komplex som bildas av den mänskliga deubiquitinase BAP1 och DEUBiquitinase adapter (DEUBAD) domän av dess Co-Factor ASXL2. Dessa analyser av ubiquitination och deubiquitination kan utföras i samband med antingen rekombinanta nukleosomer som bereds med bakterierenade proteiner eller inhemska nukleosomer som renas från däggdjursceller. Vi belyser de krångligheter som kan ha en betydande inverkan på dessa reaktioner och vi föreslår att de allmänna principerna i dessa protokoll snabbt kan anpassas till andra E3 ubiquitin Ligaser och deubiquitinases.
Introduction
Ubiquitination är en av de mest bevarade post-translationella modifieringar och är kritisk för en mängd olika organismer, inklusive jäst, växter och ryggradsdjur. Ubiquitination består av den kovalent fastsättning av ubiquitin, en mycket bevarad 76 Amino Acid polypeptid, att rikta proteiner och förekommer i tre sekventiella steg med tre enzymer, dvs E1-aktiverande, E2-konjugating och E3 Ligase1, 2,3. Denna post-translationella modifiering spelar centrala roller i ett brett spektrum av biologiska processer. Faktum är att E3 ligases, som ger specificiteten av reaktionen, utgör en stor superfamilj av enzymer och är de vanligast förekommande enzymerna i ubiquitin systemet4,5,6. De efterföljande effekterna av protein ubiquitination beror på arten av förändringen: monoubiquitination, multi-monoubiquitination, och linjär eller förgrenade polyubiquitination. Monoubiquitination är sällan förknippad med proteasomen nedbrytning, men i stället denna modifiering är involverad i medla olika signalering händelser. Polyubiquitination innebär N-terminalen eller lysin rester i ubiquitin molekyl själv, och ödet för ett polyubiquitinated protein beror på vilka rester är inblandade i ubiquitin kedje förlängning. Det har länge varit känt att polvubiquitinering medierad av lysin 48 av ubiquitin inducerar proteasomen nedbrytning. Tvärtom, polvubiquitinering via lysin 63 av ubiquitin är ofta förknippad med protein aktiveringen7,8,9. Liknar andra viktiga post-translationella modifieringar, ubiquitination är reversibel och ubiquitin avlägsnande från proteiner säkerställs genom specifika proteaser kallas deubiquitinases (DUBs), som har vuxit fram som viktiga regulatorer av cellulära processer 2 , 10. viktigt, många dubs är mycket specialiserade, och reglera, genom deubiquitination, specifika substrat, vilket indikerar att en fin balans mellan ubiquitination och deubiquitination är avgörande för proteinfunktion. E3s och dubs, tillsammans med proteasom nedbrytning maskiner och tillbehör faktorer, bildar ubiquitin proteasom systemet (UPS, med > 1200 gener) som reglerar större signalering vägar, av vilka flera är förknippade med celltillväxt och proliferation, cell öde bestämning, differentiering, cell migration, och celldöd. Viktigare, avreglering av flera signalering kaskader som involverar ubiquitination främjar tumorigenes och neurodegeneration sjukdomar5,11,12,13, 14.
Ubiquitination spelar genomgripande roller i kromatin biologi och DNA-beroende processer15,16,17. Till exempel, monoubiquitination av Histon H2A på lysin 119 (hädanefter H2A K119ub) är en kritisk post-translationella modifiering inblandade i transkriptionella förtryck och DNA Repair18,19,20, 21,22. H2A K119ub katalyseras av Polycomb repressiva Complex 1 (PRC1), som spelar en nyckelroll i upprätthållandet av epigenetisk information och är starkt bevarad från Drosophila till människa. Canonical PRC1 utgörs särskilt av RING1B och BMI1, som är det centrala E3 ubiquitin Ligase-komplexet som ansvarar för den ovan nämnda ubiquitination-händelsen22,23. I Drosophila, H2A monoubiquitination (H2A K118ub som motsvarar H2A K119ub i mammalians) är omvänd av Dub Calypso, som interagerar med ytterligare sex kam (ASX) bildar polycomb-REPRESSIVA Dub (PR-Dub) komplex24. Den däggdjur ortoolog Calypso, BAP1, är en tumör suppressor bort eller inaktiveras i olika mänskliga maligniteter25,26,27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33. BAP1 reglerar DNA-beroende processer i kärnan och kalciumsignalerad apoptos vid endoplasmatiska Retikulum33,34,35,36, 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. BAP1 monterar flera subunit proteinkomplex som innehåller transkription regulatorer särskilt ASXL1, ASXL2 och ASXL3 (asxls), tre ortologer av ASX38,43. Asxls använda den deubiquitinase adaptern (deubad) domän, också benämnd asxm domän, till stimulera BAP1 Dub aktivitet35,36,44. Därför asxls spela viktiga roller i samordningen BAP1 Dub aktivitet på kromatin och mer allmänt dess tumör suppressor funktion.
Det finns flera metoder för att studera ubiquitination och deubiquitination processer. I synnerhet är biokemiska analyser med proteiner som renas från bakterier mycket kraftfulla för att demonstrera direkt ubiquitination av, eller avlägsnande av ubiquitin från, specifika substrat. Dessa experiment kan utföras för att undersöka en rad parametrar såsom bestämning av kravet på minimala komplex, bestämning av reaktionskinetik, definition av struktur/funktionsförhållanden och förståelse av effekterna av patologiska genmutationer. Här, vi tillhandahåller protokoll för att genomföra ubiquitination och deubiquitination reaktioner på kromatin substrat med renade komponenter. Som modellsystem, in vitro -ubiquitination och deubiquitination av nukleosomalt H2A protein presenteras. Bakterier-renade proteiner monterade i minimala komplex av RING1B/BMI1 och BAP1/DEUBAD används för ubiquitination eller deubiquitination av nukleosomal H2A, respektive.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det finns flera fördelar med att etablera robusta in vitro ubiquitination och deubiquitination analyser för proteiner av intresse. Dessa analyser kan användas för att: (i) fastställa optimala förhållanden och definiera minimala krav för dessa reaktioner, (II) bestämma enzymatiska kinetiska och biokemiska konstanter, (III) definiera rollerna för kofaktorer eller hämmare som kan påverka dessa reaktioner, (IV) identifiera interaktions gränssnitt, (v) testa effekterna av artificiella eller sjukdomsassocierade mu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Diana Adjaoud för teknisk assistans. Detta arbete stöddes av bidrag från naturvetenskapliga och tekniska forskningsrådet i Kanada (2015-2020), Genome Quebec (2016-2019) och genom Canada (2016-2019) till E.B.A. E.B.A. är en senior lärd i fonds de la Recherche du Québec-santé (FRQ-S). L. M och N.S.K. har ett doktorandstipendium från FRQ-S. H. B hade ett doktorandstipendium från ministeriet för högre utbildning och från vetenskaplig forskning i Tunisien och stiftelsen Cole.
Materials
| Amylose agarose beads | New England Biolabs | #E8021 | |
| Amicon Ultra 0.5 ml centrifugal filters 10K | Sigma-Aldrich | #UFC501096 | |
| Anti-H2AK119ub (H2Aub) | Cell Signaling Technology | #8240 | |
| Anti-Flag-agarose beads | Sigma-Aldrich | #A4596 | |
| Anti-protease cocktail | Sigma-Aldrich | #P8340 | |
| BL21 (DE3) CodonPlus-RIL bacteria | Agilent technologies | #230240 | |
| DMEM | Wisent | #319-005-CL | |
| Empty chromatography column | Biorad | #731-1550 | |
| Flag peptide | Sigma-Aldrich | #F3290 | |
| GSH-agarose beads | Sigma-Aldrich | #G4510 | |
| HEK293T | ATCC | #CRL-3216 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | #I5513 | |
| Micrococcal nuclease (MNase) | Sigma-Aldrich | #N3755 | |
| Ni-NTA agarose beads | ThermoFisher Scientific | #88221 | |
| N-methylmaleimide (NEM) | Bioshop | #ETM222 | |
| Pore syringe filter 0.45 μm | Sarstedt | #83.1826 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Polysciences Inc | #23966-1 | |
| pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109) | Addgene | #63139 | |
| Ub Activating Enzyme (UBE1) | Boston Biochem | #E-305 | |
| UBCH5C (UBE2D3) | Boston Biochem | #E2-627 |
Referências
- Ye, Y., Rape, M. Building ubiquitin chains: E2 enzymes at work. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 755-764 (2009).
- Komander, D., Clague, M. J., Urbe, S. Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 550-563 (2009).
- Ciechanover, A. The unravelling of the ubiquitin system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, 322-324 (2015).
- Nakayama, K. I., Nakayama, K. Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer. Nature Reviews Cancer. 6, 369-381 (2006).
- Senft, D., Qi, J., Ronai, Z. A. Ubiquitin ligases in oncogenic transformation and cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 18, 69-88 (2018).
- Zheng, N., Shabek, N. Ubiquitin Ligases: Structure, Function, and Regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).
- Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. Linear ubiquitin chains. NF-kappaB signalling, cell death and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15, 503-508 (2014).
- Kulathu, Y., Komander, D. Atypical ubiquitylation – the unexplored world of polyubiquitin beyond Lys48 and Lys63 linkages. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13, 508-523 (2012).
- Yau, R., Rape, M. The increasing complexity of the ubiquitin code. Nature Cell Biology. 18, 579-586 (2016).
- Mevissen, T. E. T., Komander, D. Mechanisms of Deubiquitinase Specificity and Regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 159-192 (2017).
- Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 29-46 (2011).
- Minton, K. Inflammasomes: Ubiquitin lines up for inflammasome activity. Nature Reviews Immunology. 14, 580-581 (2014).
- Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20, 1242-1253 (2014).
- Upadhyay, A., Amanullah, A., Chhangani, D., Mishra, R., Mishra, A. Selective multifaceted E3 ubiquitin ligases barricade extreme defense: Potential therapeutic targets for neurodegeneration and ageing. Ageing Research Reviews. 24, 138-159 (2015).
- Hammond-Martel, I., Yu, H., Affar el, B. Roles of ubiquitin signaling in transcription regulation. Cellular Signalling. 24, 410-421 (2012).
- Schwertman, P., Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Regulation of DNA double-strand break repair by ubiquitin and ubiquitin-like modifiers. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 379-394 (2016).
- Uckelmann, M., Sixma, T. K. Histone ubiquitination in the DNA damage response. DNA Repair. 56, 92-101 (2017).
- Robzyk, K., Recht, J., Osley, M. A. Rad6-dependent ubiquitination of histone H2B in yeast. Science. 287, 501-504 (2000).
- Hwang, W. W., et al. A conserved RING finger protein required for histone H2B monoubiquitination and cell size control. Molecular Cell. 11, 261-266 (2003).
- Kim, J., Hake, S. B., Roeder, R. G. The human homolog of yeast BRE1 functions as a transcriptional coactivator through direct activator interactions. Molecular Cell. 20, 759-770 (2005).
- Wood, A., et al. an E3 ubiquitin ligase required for recruitment and substrate selection of Rad6 at a promoter. Molecular Cell. 11, 267-274 (2003).
- Wang, H., et al. Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing. Nature. 431, 873-878 (2004).
- Buchwald, G., et al. Structure and E3-ligase activity of the Ring-Ring complex of polycomb proteins Bmi1 and Ring1B. The EMBO Journal. 25, 2465-2474 (2006).
- Scheuermann, J. C., et al. Histone H2A deubiquitinase activity of the Polycomb repressive complex PR-DUB. Nature. 465, 243-247 (2010).
- Jensen, D. E., et al. BAP1: a novel ubiquitin hydrolase which binds to the BRCA1 RING finger and enhances BRCA1-mediated cell growth suppression. Oncogene. 16, 1097-1112 (1998).
- Harbour, J. W., et al. Frequent mutation of BAP1 in metastasizing uveal melanomas. Science. 330, 1410-1413 (2010).
- Abdel-Rahman, M. H., et al. GermLine BAP1 mutation predisposes to uveal melanoma, lung adenocarcinoma, meningioma, and other cancers. Journal of Medical Genetics. , (2011).
- Bott, M., et al. The nuclear deubiquitinase BAP1 is commonly inactivated by somatic mutations and 3p21.1 losses in malignant pleural mesothelioma. Nature Genetics. 43, 668-672 (2011).
- Goldstein, A. M. GermLine BAP1 mutations and tumor susceptibility. Nature Genetics. 43, 925-926 (2011).
- Testa, J. R., et al. GermLine BAP1 mutations predispose to malignant mesothelioma. Nature Genetics. 43, 1022-1025 (2011).
- Wiesner, T., et al. GermLine mutations in BAP1 predispose to melanocytic tumors. Nature Genetics. 43, 1018-1021 (2011).
- Dey, A., et al. Loss of the tumor suppressor BAP1 causes myeloid transformation. Science. 337, 1541-1546 (2012).
- Pena-Llopis, S., et al. BAP1 loss defines a new class of renal cell carcinoma. Nature Genetics. 44, 751-759 (2012).
- Bononi, A., et al. BAP1 regulates IP3R3-mediated Ca2+ flux to mitochondria suppressing cell transformation. Nature. 546, 549-553 (2017).
- Daou, S., et al. Monoubiquitination of ASXLs controls the deubiquitinase activity of the tumor suppressor BAP1. Nature Communications. 9, 4385 (2018).
- Daou, S., et al. The BAP1/ASXL2 Histone H2A Deubiquitinase Complex Regulates Cell Proliferation and Is Disrupted in Cancer. The Journal of Biological Chemistry. 290, 28643-28663 (2015).
- Mashtalir, N., et al. Autodeubiquitination protects the tumor suppressor BAP1 from cytoplasmic sequestration mediated by the atypical ubiquitin ligase UBE2O. Molecular Cell. 54, 392-406 (2014).
- Yu, H., et al. The ubiquitin carboxyl hydrolase BAP1 forms a ternary complex with YY1 and HCF-1 and is a critical regulator of gene expression. Molecular and Cellular Biology. 30, 5071-5085 (2010).
- Yu, H., et al. Tumor suppressor and deubiquitinase BAP1 promotes DNA double-strand break repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 285-290 (2014).
- Dai, F., et al. BAP1 inhibits the ER stress gene regulatory network and modulates metabolic stress response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 3192-3197 (2017).
- Zhang, Y., et al. BAP1 links metabolic regulation of ferroptosis to tumour suppression. Nature Cell Biology. 20, 1181-1192 (2018).
- Kolluri, K. K., et al. Loss of functional BAP1 augments sensitivity to TRAIL in cancer cells. eLife. 7, (2018).
- Machida, Y. J., Machida, Y., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Dutta, A. The deubiquitinating enzyme BAP1 regulates cell growth via interaction with HCF-1. The Journal of Biological Chemistry. , (2009).
- Sahtoe, D. D., van Dijk, W. J., Ekkebus, R., Ovaa, H., Sixma, T. K. BAP1/ASXL1 recruitment and activation for H2A deubiquitination. Nature Communications. 7, 10292 (2016).
