Microscopia di tracciamento a singola molecola - Uno strumento per determinare gli stati diffusivi delle molecole citosoliche

Summary

La microscopia di localizzazione 3D a molecola singola viene utilizzata per sondare le posizioni spaziali e le traiettorie di movimento delle proteine fluorescenti etichettate nelle cellule batteriche viventi. Il protocollo sperimentale e di analisi dei dati descritto nel presente documento determina i comportamenti diffusivi prevalenti delle proteine citosoliche basate su traiettorie a singola molecola raggruppate.

Abstract

La microscopia di localizzazione a singola molecola sonda la posizione e i movimenti delle singole molecole nelle cellule viventi con decine di nanometri di risoluzione spaziale e temporale al millisecondo. Queste capacità rendono la microscopia di localizzazione a singola molecola ideale per studiare le funzioni biologiche a livello molecolare in ambienti fisiologicamente rilevanti. Qui, dimostriamo un protocollo integrato per l’acquisizione e l’elaborazione/analisi di dati di tracciamento a singola molecola per estrarre i diversi stati diffusive che una proteina di interesse può mostrare. Queste informazioni possono essere utilizzate per quantificare la formazione di complessi molecolari nelle cellule viventi. Forniamo una descrizione dettagliata di un esperimento di localizzazione 3D a singola molecola basato su telecamera, così come le successive fasi di elaborazione dei dati che producono le traiettorie delle singole molecole. Queste traiettorie vengono quindi analizzate utilizzando un quadro di analisi numerica per estrarre gli stati diffusi prevalenti delle molecole fluorescenti etichettate e l’abbondanza relativa di questi stati. Il quadro di analisi si basa su simulazioni stocastiche di traiettorie di diffusione browniana intracellulari che sono confinate spazialmente da una geometria cellulare arbitraria. Sulla base delle traiettorie simulate, le immagini a singola molecola grezze vengono generate e analizzate allo stesso modo delle immagini sperimentali. In questo modo, le limitazioni sperimentali di precisione e precisione, che sono difficili da calibrare sperimentalmente, sono esplicitamente incorporate nel flusso di lavoro di analisi. Il coefficiente di diffusione e le frazioni di popolazione relativa degli stati diffusi sono determinati adattando le distribuzioni di valori sperimentali utilizzando combinazioni lineari di distribuzioni simulate. Dimostriamo l’utilità del nostro protocollo risolvendo gli stati diffusivi di una proteina che presenta diversi stati diffusi dopo la formazione di complessi omo- ed etero-oligomerici nel citosol di un patogeno batterico.

Introduction

L’esame del comportamento diffuso delle biomolecole fornisce informazioni sulle loro funzioni biologiche. Le tecniche basate sulla microscopia a fluorescenza sono diventate strumenti preziosi per osservare le biomolecole nel loro ambiente cellulare nativo. Il recupero della fluorescenza dopo la fotobleaching (FRAP) e la spettroscopia di correlazione della fluorescenza (FCS)¹ forniscono comportamenti diffusischi con la media dell’insieme. Al contrario, la microscopia di localizzazione a singola molecola consente l’osservazione di singole molecole fluorescenti con alta risoluzione spaziale e temporale^2,3,4. Osservare singole molecole è vantaggioso poiché una proteina di interesse può esistere in diversi stati diffusivi. Ad esempio, due stati diffusivi facilmente distinguibili sorgono quando un regolatore trascrizionale, come CueR in Escherichia coli, si diffonde liberamente nel citosol o si lega a una sequenza di DNA e diventa immobilizzato sulla scala cronologica della misurazione⁵ . Il tracciamento a singola molecola fornisce uno strumento per osservare direttamente questi diversi stati e non sono necessarie analisi sofisticate per risolverli. Tuttavia, diventa più difficile risolvere più stati diffusi e le loro frazioni di popolazione nei casi in cui i loro tassi di diffusione sono più simili. Ad esempio, a causa della dipendenza dalle dimensioni del coefficiente di diffusione, i diversi stati di oligomerizzazione di una proteina si manifestano come diversi stati diffusivi^{6,7,8,9 , 10}. Tali casi richiedono un approccio integrato in termini di acquisizione, trattamento e analisi dei dati.

Un fattore critico che influenza i tassi diffusivi delle molecole citosoliche è l’effetto del confinamento attraverso il confine cellulare. Le restrizioni imposte al movimento molecolare da un confine cellulare batterico fanno sì che il tasso di diffusione misurato di una molecola citononica appaia più lenta rispetto a quando lo stesso movimento si fosse verificato in uno spazio non confinato. Per le molecole che si difcizzano molto lentamente, l’effetto del confinamento cellulare è trascurabile a causa della mancanza di collisioni con il confine. In questi casi, può essere possibile risolvere con precisione gli stati diffusivi adattando le distribuzioni di spostamenti molecolari, ro coefficienti di diffusione apparente, D ,utilizzando modelli analitici basati sulle equazioni per il moto browniano ( diffusione casuale)^11,12,13. Tuttavia, per la rapida comfazione delle molecole citosoliche, le distribuzioni sperimentali non assomigliano più a quelle ottenute per il moto browniano non confinato a causa di collisioni di molecole che diffondevano i confini cellulari. Gli effetti di confinamento devono essere presi in considerazione per determinare con precisione i coefficienti di diffusione non confinati delle molecole fluorescenti. Recentemente sono stati sviluppati diversi approcci per tenere conto degli effetti di confinamento (semi-)analiticamente ^5,14,15,16 o numericamente attraverso simulazioni Monte Carlo di Diffusione browniana^{6,10,16,17,18,19}.

Qui, forniamo un protocollo integrato per la raccolta e l’analisi dei dati di microscopia di localizzazione a singola molecola con particolare attenzione al tracciamento a singola molecola. L’obiettivo finale del protocollo è quello di risolvere gli stati diffusivi di proteine citosoliche fluorescenti all’interno, in questo caso, cellule batteriche a forma di asta. Il nostro lavoro si basa su un protocollo precedente per il tracciamento a singola molecola, in cui una polimerasi di DNA, PolI, ha dimostrato di esistere in uno stato legato al DNA e non legato dall’analisi di diffusione²⁰. Qui, espandiamo l’analisi di tracciamento a singola molecola a misurazioni 3D ed eseguiamo simulazioni computazionali più realistiche per risolvere e quantificare più stati diffusi contemporaneamente presenti nelle cellule. I dati vengono acquisiti utilizzando un microscopio a fluorescenza a super-risoluzione 3D costruito in casa che è in grado di determinare la posizione 3D degli emettitori fluorescenti mediante l’imaging con la funzione di diffusione del punto a doppia elica (DHPSF)^21,22. Le immagini a singola molecola grezze vengono elaborate utilizzando un software scritto su misura per estrarre le localizzazioni 3D a singola molecola, che vengono poi combinate in traiettorie a singola molecola. Migliaia di traiettorie sono raggruppate per generare distribuzioni di coefficienti di diffusione apparente. In una fase finale, le distribuzioni sperimentali sono in sintonia con distribuzioni generate numericamente ottenute attraverso simulazioni Monte-Carlo di moto browniano in un volume limitato. Applichiamo questo protocollo per risolvere gli stati diffusidella proteina YscQ del sistema di secrezione di tipo 3 nella Yersinia enterocoliticavivente. A causa della sua natura modulare, il nostro protocollo è generalmente applicabile a qualsiasi tipo di esperimento di tracciamento a singola molecola o a particella singola in geometrie cellulari arbitrarie.

Protocol

1. Calibrazione a doppia elica point-spread-function NOTA: le immagini descritte in questa e nelle sezioni seguenti vengono acquisite utilizzando un microscopio a fluorescenza invertito personalizzato, come descritto in Rocha et al.23. La stessa procedura è applicabile a diverse implementazioni al microscopio progettate per la localizzazione di una singola molecola e la microscopia di tracciamento2,3,<…

Representative Results

Nelle condizioni sperimentali qui descritte (20.000 fotogrammi, lunghezza minima di 4 localizzazioni) e a seconda dei livelli di espressione delle proteine di fusione fluorescenti, circa 200-3.000 localizzazioni che producono 10-150 le traiettorie possono essere generate per cella (Figura 2a,b). Un gran numero di traiettorie è necessario per produrre una distribuzione ben campionata di coefficienti di diffusione apparente. La dimensione del …

Discussion

Un fattore critico per la corretta applicazione del protocollo presentato è quello di garantire che i segnali a singola molecola siano ben separati l’uno dall’altro (cioè, devono essere sparse nello spazio e nel tempo (Supplementary Mov. 1)). Se c’è più di una molecola fluorente in una cellula allo stesso tempo, la localizzazione potrebbe essere erroneamente assegnata alla traiettoria di un’altra molecola. Questo è indicato come il problema di collegamento³⁰. Per evitare il p…

Materials

2,6-diaminopimelic acid	Chem Impex International	5411	Necessary for growth of Y. enterocolitica cells used.
4f lenses	Thorlabs	AC508-080-A	f = 80mm, 2"
514 nm laser	Coherent	Genesis MX514 MTM	Use for fluorescence excitation
agarose	Inivtrogen	16520100	Used to make gel pads to mount liquid bacterial sample on microscope.
ammonium chloride	Sigma Aldrich	A9434	M2G ingredient.
bandpass filter	Chroma	ET510/bp	Excitation pathway.
Brain Heart Infusion	Sigma Aldrich	53286	Growth media for Y. enterocolitica.
calcium chloride	Sigma Aldrich	223506	M2G ingredient.
camera	Imaging Source	DMK 23UP031	Camera for phase contrast imaging.
dielectric phase mask	Double Helix, LLC	N/A	Produces DHPSF signal.
disodium phosphate	Sigma Aldrich	795410	M2G ingredient.
ethylenediaminetetraacetic acid	Fisher Scientific	S311-100	Chelates Ca2+. Induces secretion in the T3SS.
flip mirror	Newport	8892-K	Allows for switching between fluorescence and phase contrast pathways.
fluospheres	Invitrogen	F8792	Fluorescent beads. 540/560 exication and emission wavelengths. 40 nm diameter.
glass cover slip	VWR	16004-302	#1.5, 22mmx22mm
glucose	Chem Impex International	811	M2G ingredient.
immersion oil	Olympus	Z-81025	Placed on objective lens.
iron(II) sulfate	Sigma Aldrich	F0518	M2G ingredient.
long pass filter	Semrock	LP02-514RU-25	Emission pathway.
magnesium sulfate	Fisher Scientific	S25414A	M2G ingredient.
microscope platform	Mad City Labs	custom	Platform for inverted microscope.
nalidixic acid	Sigma Aldrich	N4382	Y. enterocolitica cells used are resistant to nalidixic acid.
objective lens	Olympus	1-U2B991	60X, 1.4 NA
Ozone cleaner	Novascan	PSD-UV4	Used to eliminate background fluorescence on glass cover slips.
potassium phosphate	Sigma Aldrich	795488	M2G ingredient.
Red LED	Thorlabs	M625L3	Illuminates sample for phase contrast imaging. 625nm.
sCMOS camera	Hamamatsu	ORCA-Flash 4.0 V2	Camera for fluorescence imaging.
short pass filter	Chroma	ET700SP-2P8	Emission pathway.
Tube lens	Thorlabs	AC508-180-A	f=180 mm, 2"
Yersinia enterocolitica dHOPEMTasd	N/A	N/A	Strain AD4442, eYFP-YscQ
zero-order quarter-wave plate	Thorlabs	WPQ05M-514	Excitation pathway.