JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioquímica

Single-molekyl tracking mikroskopi-ett verktyg för att bestämma Diffusiva stater cytosoliska molekyler

Published: September 05, 2019
doi:
10.3791/59387
,
1Department of Chemistry,University of Virginia, 2Department of Molecular Physiology & Biological Physics,University of Virginia School of Medicine

Summary

3D Single-molekylen lokalisering mikroskopi utnyttjas för att söka de rumsliga positioner och rörelsebanor av överföras märkta proteiner i levande bakterieceller. Den experimentella och dataanalys protokoll som beskrivs häri avgör de utbredda diffusiva beteenden av cytosoliska proteiner baserade på poolade enda molekyl Trajectories.

Abstract

Single-molekylen lokalisering mikroskopi sonder ställning och rörelser enskilda molekyler i levande celler med tiotals nanometer rumsliga och millisekund temporal upplösning. Dessa funktioner gör Single-molekylen lokalisering mikroskopi idealisk för att studera molekylär nivå biologiska funktioner i fysiologiskt relevanta miljöer. Här visar vi ett integrerat protokoll för både förvärv och bearbetning/analys av Single-molekyl spårningsdata för att extrahera de olika diffusiva staterna ett protein av intresse kan uppvisa. Denna information kan användas för att kvantifiera molekylär komplex formation i levande celler. Vi ger en detaljerad beskrivning av en Kamerabaserad 3D Single-molekyl lokalisering experiment, samt de efterföljande databehandling steg som ger banor av enskilda molekyler. Dessa banor analyseras sedan med hjälp av en numerisk analysram för att extrahera de utbredda diffusiva staterna av fluorescerande märkta molekyler och den relativa överflöd av dessa stater. Analysramen är baserad på stokastiska simuleringar av intracellulära Brownian diffusion banor som är rumsligt begränsas av en godtycklig cell geometri. Baserat på de simulerade banor, RAW Single-molekylen bilder genereras och analyseras på samma sätt som experimentella bilder. På så sätt införlivas experimentella precisions-och noggrannhets begränsningar, som är svåra att kalibrera experimentellt, uttryckligen i analys arbetsflödet. Diffusion koefficienten och relativa befolknings fraktioner av de förhärskande diffusiva staterna bestäms genom att montera distributioner av experimentella värden med hjälp av linjära kombinationer av simulerade distributioner. Vi visar nyttan av vårt protokoll genom att lösa de diffusiva staterna av ett protein som uppvisar olika diffusiva stater på att bilda homo-och hetero-oligomerska komplex i cytosolen av en bakteriell patogen.

Introduction

Att undersöka de diffusiva beteendet hos biomolekyler ger insikt i deras biologiska funktioner. Fluorescensmikroskopi-baserade tekniker har blivit värdefulla verktyg för observation av biomolekyler i sin naturliga cell miljö. Fluorescens återhämtning efter photoblekning (FRAP) och fluorescens korrelation spektroskopi (FCS)1 ger Ensemble-genomsnitt diffusiva beteenden. Omvänt, Single-molekylen lokalisering mikroskopi möjliggör observation av enskilda Fluorescent märkta molekyler med hög rumslig och temporala upplösning2,3,4. Observation enskilda molekyler är fördelaktigt eftersom ett protein av intresse kan existera i olika diffusiva stater. Till exempel, två lätt urskiljbara diffusiva stater uppstår när en transkriptionell regulator, såsom CueR i Escherichia coli, difsar fritt i Cytosol eller binder till en DNA-sekvens och blir immobiliserade på tidsskalan för mätning5 . Single-molekyl tracking ger ett verktyg för att observera dessa olika stater direkt, och sofistikerade analyser krävs inte för att lösa dem. Emellertid, det blir mer utmanande att lösa flera diffusiva stater och deras befolknings fraktioner i fall där deras diffusa priser är mer likartade. Till exempel på grund av storleksanpassa beroendet av diffusions koefficienten, påstår olik oligomerisering av ett protein manifesterar sig som olik diffusiv påstår6,7,8,9 , 10. sådana fall kräver ett integrerat förhållningssätt när det gäller datainsamling, behandling och analys.

En kritisk faktor som påverkar diffusiva frekvenser av cytosoliska molekyler är effekten av instängdhet av cellgränsen. De restriktioner som ställs på molekylär rörelse av en bakteriecell gräns orsaka en cytosoliska molekyler uppmätta diffusionshastighet att visas långsammare än om samma rörelse hade inträffat i ett oinskränkt utrymme. För mycket långsamt diffusa molekyler, effekten av cellulära instängdhet är försumbar på grund av bristen på kollisioner med gränsen. I sådana fall kan det vara möjligt att korrekt lösa diffusions tillstånd genom att montera fördelningarna av molekylära förskjutningar, reller skenbara diffusions koefficienter, D *, med hjälp av analytiska modeller baserade på ekvationerna för Brownsk rörelse ( slumpmässig diffusion)11,12,13. Men för snabba diffusa cytosoliska molekyler, de experimentella distributioner inte längre likna de som erhållits för oinskränkt Brownsk rörelse på grund av kollisioner av diffuserande molekyler med cell gränser. Nedsättningseffekter måste redovisas för att exakt bestämma de oinskränkta diffusions koefficienterna för de fluorescerande molekyler som är märkta. Flera metoder har nyligen utvecklats för att ta hänsyn till instängning antingen (semi-) analytiskt 5,14,15,16 eller numeriskt genom Monte Carlo-simuleringar av Brownian diffusion6,10,16,17,18,19.

Här ger vi ett integrerat protokoll för att samla in och analysera Single-molekylen lokalisering mikroskopi data med ett särskilt fokus på Single-molekyl spårning. Slutmålet med protokollet är att lösa diffusa tillstånd av fluorescerande märkta cytosoliska proteiner inuti, i detta fall, stavformade bakterieceller. Vårt arbete bygger på ett tidigare protokoll för Single-molekyl spårning, där en DNA-polymeras, PolI, visades att existera i en DNA-bunden och obunden stat genom diffusion analys20. Här expanderar vi Single-molekyl spårningsanalys till 3D mätningar och utföra mer realistiska beräknings simuleringar för att lösa och kvantifiera flera diffusiva stater samtidigt närvarande i celler. Datan är förvärvat användande en hem-bygget 3D toppen-beslutsamhet fluorescens Mikroskop vilken är skicklig av beslutande den 3D position av fluorescerande sändare vid tänkbar med det dubbel-Helix punkt-breda-funktion (dhpsf)21,22. RAW Single-molekylen bilder bearbetas med hjälp av skräddarsydda program för att extrahera 3D Single-molekyl lokaliseringar, som sedan kombineras till enmolekyl banor. Tusentals banor slås samman för att generera fördelningar av skenbara diffusions koefficienter. I ett sista steg är de experimentella distributionerna lämpade med numeriskt genererade fördelningar erhållna genom Monte-Carlo-simuleringar av Brownian-rörelse i en begränsad volym. Vi tillämpar detta protokoll för att lösa diffusiva stater av typ 3 sekretion system protein YscQ i levande yersinia enterocolitica. På grund av sin modulära natur, är vårt protokoll i allmänhet gäller för alla typer av Single-molekyl eller Single-partikel tracking experiment i godtyckliga cell geometrier.

Protocol

1. dubbel-Helix punkt-spread-funktion Kalibrering Obs: bilder som beskrivs i detta och följande avsnitt förvärvas med hjälp av ett specialbyggt inverterat fluorescens-Mikroskop, som beskrivs i Rocha et al.23. Samma förfarande gäller för olika Mikroskop implementeringar avsedda för enkel molekyl lokalisering och spårning mikroskopi2,3,4. All programvara för bild anskaffn…

Representative Results

Under de experimentella förhållanden som beskrivs här (20 000 ramar, bana längd minst 4 lokaliseringar) och beroende på uttrycket nivåer av fluorescerande märkta fusions proteiner, cirka 200-3000 lokaliseringar ger 10-150 banor kan genereras per cell (figur 2A, b). Ett stort antal banor är nödvändiga för att producera en väl samplad fördelning av skenbara diffusions koefficienter. Storleken på FOV samlas här är ~ 55 x 55 μm, …

Discussion

En kritisk faktor för en framgångsrik tillämpning av det presenterade protokollet är att säkerställa att enmolekylens signaler är väl åtskilda från varandra (dvs. de måste vara glesa i rymden och i tid (kompletterande MOV. 1)). Om det finns mer än en fluorescerande molekyl i en cell på samma gång, kan lokaliseringen felaktigt tilldelas en annan molekylers bana. Detta kallas det länkade problemet30. Experimentella förhållanden, såsom protein uttrycks nivåer och e…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi tackar Alecia Achimovich och ting Yan för kritisk läsning av manuskriptet. Vi tackar Ed Hall, Senior personal forskare i Advanced Research Computing Services Group vid University of Virginia, för hjälp med att inrätta optimerings rutiner som används i detta arbete. Finansiering för detta arbete tillhandahölls av University of Virginia.

Materials

2,6-diaminopimelic acid Chem Impex International 5411 Necessary for growth of Y. enterocolitica cells used.
4f lenses Thorlabs AC508-080-A f = 80mm, 2"
514 nm laser Coherent Genesis MX514 MTM Use for fluorescence excitation
agarose Inivtrogen 16520100 Used to make gel pads to mount liquid bacterial sample on microscope.
ammonium chloride Sigma Aldrich A9434 M2G ingredient.
bandpass filter Chroma ET510/bp Excitation pathway.
Brain Heart Infusion Sigma Aldrich 53286 Growth media for Y. enterocolitica.
calcium chloride Sigma Aldrich 223506 M2G ingredient.
camera Imaging Source DMK 23UP031 Camera for phase contrast imaging.
dielectric phase mask Double Helix, LLC N/A Produces DHPSF signal.
disodium phosphate Sigma Aldrich 795410 M2G ingredient.
ethylenediaminetetraacetic acid Fisher Scientific S311-100 Chelates Ca2+. Induces secretion in the T3SS.
flip mirror Newport 8892-K Allows for switching between fluorescence and phase contrast pathways.
fluospheres Invitrogen F8792 Fluorescent beads. 540/560 exication and emission wavelengths. 40 nm diameter.
glass cover slip VWR 16004-302 #1.5, 22mmx22mm
glucose Chem Impex International 811 M2G ingredient.
immersion oil Olympus Z-81025 Placed on objective lens.
iron(II) sulfate Sigma Aldrich F0518 M2G ingredient.
long pass filter Semrock LP02-514RU-25 Emission pathway.
magnesium sulfate Fisher Scientific S25414A M2G ingredient.
microscope platform Mad City Labs custom Platform for inverted microscope.
nalidixic acid Sigma Aldrich N4382 Y. enterocolitica cells used are resistant to nalidixic acid.
objective lens Olympus 1-U2B991 60X, 1.4 NA
Ozone cleaner Novascan PSD-UV4 Used to eliminate background fluorescence on glass cover slips.
potassium phosphate Sigma Aldrich 795488 M2G ingredient.
Red LED Thorlabs M625L3 Illuminates sample for phase contrast imaging. 625nm.
sCMOS camera Hamamatsu ORCA-Flash 4.0 V2 Camera for fluorescence imaging.
short pass filter Chroma ET700SP-2P8 Emission pathway.
Tube lens Thorlabs AC508-180-A f=180 mm, 2"
Yersinia enterocolitica dHOPEMTasd N/A N/A Strain AD4442, eYFP-YscQ
zero-order quarter-wave plate Thorlabs WPQ05M-514 Excitation pathway.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Kapanidis, A. N., Uphoff, S., Stracy, M. Understanding Protein Mobility in Bacteria by Tracking Single Molecules. Journal of Molecular Biology. , (2018).
  2. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  3. Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
  4. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. W. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  5. Chen, T. Y., et al. Quantifying Multistate Cytoplasmic Molecular Diffusion in Bacterial Cells via Inverse Transform of Confined Displacement Distribution. Journal of Physical Chemistry B. 119 (45), 14451-14459 (2015).
  6. Mohapatra, S., Choi, H., Ge, X., Sanyal, S., Weisshaar, J. C. Spatial Distribution and Ribosome-Binding Dynamics of EF-P in Live Escherichia coli. mBio. 8 (3), (2017).
  7. Stracy, M., et al. Single-molecule imaging of UvrA and UvrB recruitment to DNA lesions in living Escherichia coli. Nature Communications. 7, 12568 (2016).
  8. Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data. Nature Methods. 10 (3), 265-269 (2013).
  9. Bakshi, S., Choi, H., Weisshaar, J. C. The spatial biology of transcription and translation in rapidly growing Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 6, 636 (2015).
  10. Mustafi, M., Weisshaar, J. C. Simultaneous Binding of Multiple EF-Tu Copies to Translating Ribosomes in Live Escherichia coli. mBio. 9 (1), (2018).
  11. Michalet, X., Berglund, A. J. Optimal diffusion coefficient estimation in single-particle tracking. Physical Review E. 85 (6), (2012).
  12. Michalet, X. Mean square displacement analysis of single-particle trajectories with localization error: Brownian motion in an isotropic medium. Physical Review E Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 82 (4 Pt 1), 041914 (2010).
  13. Backlund, M. P., Joyner, R., Moerner, W. E. Chromosomal locus tracking with proper accounting of static and dynamic errors. Physical Review E Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 91 (6), 062716 (2015).
  14. Stracy, M., et al. Live-cell superresolution microscopy reveals the organization of RNA polymerase in the bacterial nucleoid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (32), E4390-E4399 (2015).
  15. Plochowietz, A., Farrell, I., Smilansky, Z., Cooperman, B. S., Kapanidis, A. N. In vivo single-RNA tracking shows that most tRNA diffuses freely in live bacteria. Nucleic Acids Research. 45 (2), 926-937 (2017).
  16. Koo, P. K., Mochrie, S. G. Systems-level approach to uncovering diffusive states and their transitions from single-particle trajectories. Physical Review E. 94 (5-1), 052412 (2016).
  17. Uphoff, S., Reyes-Lamothe, R., Garza de Leon, F., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. Single-molecule DNA repair in live bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (20), 8063-8068 (2013).
  18. Bakshi, S., Bratton, B. P., Weisshaar, J. C. Subdiffraction-Limit Study of Kaede Diffusion and Spatial Distribution in Live Escherichia coli. Biophysical Journal. 101 (10), 2535-2544 (2011).
  19. Bakshi, S., Siryaporn, A., Goulian, M., Weisshaar, J. C. Superresolution imaging of ribosomes and RNA polymerase in live Escherichia coli cells. Molecular Microbiology. 85 (1), 21-38 (2012).
  20. Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking. JoVE. (85), e51177 (2014).
  21. Pavani, S. R. P., Piestun, R. Three dimensional tracking of fluorescent microparticles using a photon-limited double-helix response system. Optics Express. 16 (26), 22048-22057 (2008).
  22. Pavani, S. R. P., et al. Three-dimensional, single-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 2995-2999 (2009).
  23. Rocha, J. M., et al. Single-molecule tracking in live Yersinia enterocolitica reveals distinct cytosolic complexes of injectisome subunits. Integrative Biology. 10 (9), 502-515 (2018).
  24. Lew, M. D., von Diezmann, A. R. S., Moerner, W. E. Easy-DHPSF open-source software for three-dimensional localization of single molecules with precision beyond the optical diffraction limit. Protocol Exchange. , (2013).
  25. Biteen, J. S., et al. Super-resolution imaging in live Caulobacter crescentus cells using photoswitchable EYFP. Nature Methods. 5 (11), 947-949 (2008).
  26. Huang, F., et al. Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms. Nature Methods. 10 (7), 653-658 (2013).
  27. Hoogendoorn, E., et al. The fidelity of stochastic single-molecule super-resolution reconstructions critically depends upon robust background estimation. Scientific Reports. 4, 3854 (2014).
  28. Paintdakhi, A., et al. Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Molecular microbiology. 99 (4), 767-777 (2016).
  29. Rocha, J. M., Corbitt, J., Yan, T., Richardson, C., Gahlmann, A. Resolving Cytosolic Diffusive States in Bacteria by Single-Molecule Tracking. bioRxiv. , 483321 (2018).
  30. Lee, A., Tsekouras, K., Calderon, C., Bustamante, C., Presse, S. Unraveling the Thousand Word Picture: An Introduction to Super-Resolution Data Analysis. Chemical Reviews. 117 (11), 7276-7330 (2017).
  31. Los, G. V., et al. HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis. ACS Chemical Biology. , (2008).
  32. Gautier, A., et al. An Engineered Protein Tag for Multiprotein Labeling in Living Cells. Chemistry & Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
  33. Bisson-Filho, A. W., et al. Treadmilling by FtsZ filaments drives peptidoglycan synthesis and bacterial cell division. Science. 355 (6326), 739-743 (2017).
  34. Douglass, K. M., Sieben, C., Archetti, A., Lambert, A., Manley, S. Super-resolution imaging of multiple cells by optimised flat-field epi-illumination. Nature Photonics. 10 (11), 705-708 (2016).
  35. Zhao, Z., Xin, B., Li, L., Huang, Z. L. High-power homogeneous illumination for super-resolution localization microscopy with large field-of-view. Optics Express. 25 (12), 13382-13395 (2017).
  36. Yan, T., Richardson, C. J., Zhang, M., Gahlmann, A. Computational Correction of Spatially-Variant Optical Aberrations in 3D Single Molecule Localization Microscopy. bioRxiv. , 504712 (2018).
  37. Gahlmann, A., Moerner, W. E. Exploring bacterial cell biology with single-molecule tracking and super-resolution imaging. Nature Reviews Microbiology. 12 (1), 9-22 (2014).
  38. Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. Imaging live-cell dynamics and structure at the single-molecule level. Mol Cell. 58 (4), 644-659 (2015).
  39. Berglund, A. J. Statistics of camera-based single-particle tracking. Physical Review E. 82 (1), 011917 (2010).
  40. Parry, B. R., et al. The bacterial cytoplasm has glass-like properties and is fluidized by metabolic activity. Cell. 156 (1-2), 183-194 (2014).
  41. English, B. P., et al. Single-molecule investigations of the stringent response machinery in living bacterial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), E365-E373 (2011).
  42. Niu, L. L., Yu, J. Investigating intracellular dynamics of FtsZ cytoskeleton with photoactivation single-molecule tracking. Biophysical Journal. 95 (4), 2009-2016 (2008).
  43. Coquel, A. S., et al. Localization of protein aggregation in Escherichia coli is governed by diffusion and nucleoid macromolecular crowding effect. PLoS Computational Biology. 9 (4), e1003038 (2013).
  44. Nenninger, A., Mastroianni, G., Mullineaux, C. W. Size Dependence of Protein Diffusion in the Cytoplasm of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 192 (18), 4535-4540 (2010).
  45. Dix, J. A., Verkman, A. S. Crowding effects on diffusion in solutions and cells. Annual Review of Biophysics. 37, 247-263 (2008).
  46. Elliott, L. C., Barhoum, M., Harris, J. M., Bohn, P. W. Trajectory analysis of single molecules exhibiting non-brownian motion. Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (10), 4326-4334 (2011).

Tags

Single-molecule Tracking3D TrackingDiffusive StatesCytosolic MoleculesFluorescence MicroscopyAgarose PadYersinia EnterocoliticaCell VolumeZ-calibrationMATLABHCImage Live

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Rocha, J. M., Gahlmann, A. Single-Molecule Tracking Microscopy – A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules. J. Vis. Exp. (151), e59387, doi:10.3791/59387 (2019).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image