Single-molekylet Tracking mikroskopi-et verktøy for fastsettelse av Diffusive statene cytosolic molekyler

Summary

3D single-molekylet lokalisering mikroskopi er benyttet for å granske den romlige posisjoner og bevegelse baner av fluorescensmerkete merket proteiner i levende bakterielle celler. Den eksperimentelle og dataanalyse protokollen som er beskrevet her, bestemmer den utbredte diffusive oppførselen til cytosolic proteiner basert på samlet enkelt molekyl baner.

Abstract

Single-molekylet lokalisering mikroskopi sonder posisjon og bevegelser av individuelle molekyler i levende celler med titalls nanometer romlige og millisekunder Temporal oppløsning. Disse evnene gjør single-molekylet lokalisering mikroskopi ideelt egnet til å studere molekylær nivå biologiske funksjoner i fysiologisk relevante miljøer. Her demonstrerer vi en integrert protokoll for både anskaffelse og prosessering/analyse av sporingsdata for enkelt molekyl for å trekke ut de forskjellige diffusive statene som et protein av interesse kan vise. Denne informasjonen kan brukes til å kvantifisere molekylær kompleks dannelse i levende celler. Vi gir en detaljert beskrivelse av et kamerabasert, lokaliserings eksperiment med 3D enkelt molekyl, samt de påfølgende databehandlings trinnene som gir baner til individuelle molekyler. Disse baner blir deretter analysert ved hjelp av en numerisk analyse rammeverk for å trekke ut de utbredte diffusive statene i fluorescensmerkete merket molekyler og den relative overflod av disse statene. Analysen rammeverket er basert på Stokastisk simuleringer av intracellulære Brownske diffusjon baner som er romlig begrenset av en vilkårlig celle geometri. Basert på den simulerte baner, genereres og analyseres rå bilder med ett molekyl på samme måte som eksperimentelle bilder. På denne måten er eksperimentelle presisjons-og nøyaktighets begrensninger, som er vanskelige å kalibrere eksperimentelt, eksplisitt innlemmet i analyse arbeidsflyten. Diffusion koeffisienten og relative befolkning fraksjoner av de utbredte diffusive statene er bestemt ved å tilpasse distribusjoner av eksperimentelle verdier ved hjelp av lineære kombinasjoner av simulerte distribusjoner. Vi viser nytten av vår protokoll ved å løse de diffusive statene et protein som viser ulike diffusive stater ved forming homo-og hetero-oligomer komplekser i stoffer av en bakteriell patogen.

Introduction

Undersøke diffusive atferden til biomolekyler gir innsikt i sine biologiske funksjoner. Fluorescens mikroskopi-baserte teknikker har blitt verdifulle verktøy for å observere biomolekyler i sitt eget celle miljø. Fluorescens utvinning etter photobleaching (FRAP) og fluorescens korrelasjon spektroskopi (FCS)¹ gi ensemble-gjennomsnitt diffusive atferd. Omvendt, enkelt-molekyl lokalisering mikroskopi muliggjør observasjon av individuelle fluorescensmerkete merkede molekyler med høy romlig og tidsmessig oppløsning^2,3,4. Å observere individuelle molekyler er fordelaktig siden et protein av interesse kan eksistere i forskjellige diffusive tilstander. For eksempel, to lett gjenkjennelige diffusive tilstander oppstår når en transcriptional regulator, slik som CueR i Escherichia coli, diffunderer fritt i stoffer eller binder seg til en DNA-sekvens og blir immobilisert på tidsskalaen for måling⁵ . Enkelt-molekyl sporing gir et verktøy for å observere disse ulike statene direkte, og sofistikerte analyser er ikke nødvendig å løse dem. Imidlertid, den blir flere utfordrende å løse mangfoldig diffusive fastslår og deres befolkning brøk inne sakene der hvor deres diffusive ratene er flere lignende. For eksempel, på grunn av størrelsen avhengighet av diffusjon koeffisienten, ulike oligomerisering tilstander av et protein manifestere seg som forskjellige diffusive stater^{6,7,8,9 , 10}. slike saker krever en integrert tilnærming i form av datainnsamling, prosessering og analyse.

En kritisk faktor som påvirker diffusive utbredelsen av cytosolic molekyler, er effekten av å være i fangenskap ved cellegrensen. Restriksjonene plassert på molekylær bevegelse av en bakteriell cellegrensen føre til en cytosolic molekyler ‘ målt diffusjon rate skal vises tregere enn om den samme bevegelsen hadde skjedd i en unconfined plass. For svært langsomt spre molekyler, er effekten av cellulær fødsel ubetydelig på grunn av mangel på kollisjoner med grensen. I slike tilfeller kan det være mulig å nøyaktig løse diffusive tilstander ved å montere distribusjoner av molekylær forskyvninger, reller tilsynelatende diffusjon koeffisienter, D *, ved hjelp av analytiske modeller basert på likninger for brownske bevegelse ( tilfeldig diffusjon)^11,12,13. Men for raske spre cytosolic molekyler, de eksperimentelle distribusjonene ikke lenger ligne de innhentet for unconfined Brownske bevegelse på grunn av kollisjoner av spre molekyler med celle grenser. Fødsel effekter må regnskapsføres for å nøyaktig bestemme unconfined diffusjon koeffisienter av fluorescensmerkete merket molekyler. Flere tilnærminger har nylig blitt utviklet for å ta hensyn til fødsel effekter enten (semi-) analytisk ^5,14,15,16 eller numerisk gjennom Monte Carlo simuleringer av Brownske Diffusion^{6,10,16,17,18,19}.

Her gir vi en integrert protokoll for å samle inn og analysere enkelt molekyl lokaliserings mikroskopi data med et spesielt fokus på sporing av enkelt molekyl. Målet med protokollen er å løse diffusive tilstander av fluorescensmerkete merket cytosolic proteiner inne, i dette tilfellet, Rod-formede bakterielle celler. Arbeidet vårt bygger på en tidligere protokoll for sporing av enkelt molekyl, der en DNA-polymerase, PolI, ble vist å eksistere i en DNA-bundet og ubundet tilstand ved diffusjon analyse²⁰. Her utvider vi enkelt-molekylet sporing analyse til 3D målinger og utføre mer realistiske beregningsorientert simuleringer å løse og kvantifisere flere diffusive tilstander samtidig tilstede i cellene. Dataene er ervervet ved hjelp av en hjemmelaget 3D super-oppløsning fluorescens mikroskop som er i stand til å bestemme 3D posisjon av fluorescerende sendere ved Imaging med dobbel Helix punkt-spredning-funksjon (DHPSF)^21,22. Den rå single-molekylet bilder er behandlet ved hjelp av egendefinert skrevet programvare for å trekke ut 3D single-molekylet lokaliseringer, som deretter kombineres til ett-molekyl baner. Tusenvis av baner er samlet for å generere distribusjoner av tilsynelatende diffusjon koeffisienter. I et siste trinn, er de eksperimentelle distribusjonene passer med numerisk genererte distribusjoner innhentet gjennom Monte-Carlo simuleringer av Brownske bevegelse i et trangt volum. Vi bruker denne protokollen for å løse diffusive statene av type 3 sekresjon system protein YscQ i levende Yersinia enterocolitica. På grunn av sin modulære natur, er vår protokoll vanligvis gjelder for alle typer enkelt-molekyl eller enkelt-partikkel sporing eksperiment i vilkårlig celle geometri.

Protocol

1. dobbel Helix punkt-spredning-funksjon kalibrering Merk: bilder som er beskrevet i dette og følgende deler anskaffes ved hjelp av et spesiallaget invertert fluorescens mikroskop, som beskrevet i Rocha et al.23. Den samme fremgangsmåten gjelder for forskjellige mikroskop implementeringer som er utviklet for lokalisering og sporing av enkelt molekyl mikroskopi2,3,4. All program…

Representative Results

Under de eksperimentelle forholdene som er beskrevet her (20 000 rammer, banelengde minimum 4 lokaliseringer) og avhengig av uttrykket nivåer av fluorescensmerkete merket Fusion proteiner, ca 200-3000 lokaliseringer gir 10-150 baner kan genereres per celle (figur 2a, b). Et stort antall baner er nødvendig for å produsere en godt samplet fordeling av tilsynelatende diffusjon koeffisienter. Størrelsen på FOV samlet her er ~ 55 x 55 μm, me…

Discussion

En kritisk faktor for vellykket anvendelse av den presenterte protokollen er å sikre at single-molekylet signalene er godt adskilt fra hverandre (dvs. de må være sparsom i rommet og i tid (supplerende MOV. 1)). Hvis det er mer enn ett fluorescerende molekyl i en celle på samme tid, så lokalisering kan være feil tilordnet til en annen molekyler ‘ bane. Dette kalles linking problem³⁰. Eksperimentelle forhold, slik som protein uttrykk nivåer og eksitasjon laser intensitet kan …

Materials

2,6-diaminopimelic acid	Chem Impex International	5411	Necessary for growth of Y. enterocolitica cells used.
4f lenses	Thorlabs	AC508-080-A	f = 80mm, 2"
514 nm laser	Coherent	Genesis MX514 MTM	Use for fluorescence excitation
agarose	Inivtrogen	16520100	Used to make gel pads to mount liquid bacterial sample on microscope.
ammonium chloride	Sigma Aldrich	A9434	M2G ingredient.
bandpass filter	Chroma	ET510/bp	Excitation pathway.
Brain Heart Infusion	Sigma Aldrich	53286	Growth media for Y. enterocolitica.
calcium chloride	Sigma Aldrich	223506	M2G ingredient.
camera	Imaging Source	DMK 23UP031	Camera for phase contrast imaging.
dielectric phase mask	Double Helix, LLC	N/A	Produces DHPSF signal.
disodium phosphate	Sigma Aldrich	795410	M2G ingredient.
ethylenediaminetetraacetic acid	Fisher Scientific	S311-100	Chelates Ca2+. Induces secretion in the T3SS.
flip mirror	Newport	8892-K	Allows for switching between fluorescence and phase contrast pathways.
fluospheres	Invitrogen	F8792	Fluorescent beads. 540/560 exication and emission wavelengths. 40 nm diameter.
glass cover slip	VWR	16004-302	#1.5, 22mmx22mm
glucose	Chem Impex International	811	M2G ingredient.
immersion oil	Olympus	Z-81025	Placed on objective lens.
iron(II) sulfate	Sigma Aldrich	F0518	M2G ingredient.
long pass filter	Semrock	LP02-514RU-25	Emission pathway.
magnesium sulfate	Fisher Scientific	S25414A	M2G ingredient.
microscope platform	Mad City Labs	custom	Platform for inverted microscope.
nalidixic acid	Sigma Aldrich	N4382	Y. enterocolitica cells used are resistant to nalidixic acid.
objective lens	Olympus	1-U2B991	60X, 1.4 NA
Ozone cleaner	Novascan	PSD-UV4	Used to eliminate background fluorescence on glass cover slips.
potassium phosphate	Sigma Aldrich	795488	M2G ingredient.
Red LED	Thorlabs	M625L3	Illuminates sample for phase contrast imaging. 625nm.
sCMOS camera	Hamamatsu	ORCA-Flash 4.0 V2	Camera for fluorescence imaging.
short pass filter	Chroma	ET700SP-2P8	Emission pathway.
Tube lens	Thorlabs	AC508-180-A	f=180 mm, 2"
Yersinia enterocolitica dHOPEMTasd	N/A	N/A	Strain AD4442, eYFP-YscQ
zero-order quarter-wave plate	Thorlabs	WPQ05M-514	Excitation pathway.