Visualisierung von Germinosomes und die innere Membran in Bacillus Subtilis Sporen
Summary
Germinant Rezeptor-Proteine-Cluster in “Germinosomes” in der inneren Membran der Bacillus Subtilis Sporen. Wir beschreiben ein Protokoll mit Superresolution Mikroskopie und Leuchtstoffröhren Reporter Proteine, um Germinosomes zu visualisieren. Das Protokoll zeigt auch Spore innere Membrandomänen, die bevorzugt mit dem Membran-Farbstoff FM4-64 gefärbt sind.
Abstract
Die geringe Größe der Sporen und der relativ geringen Fülle der Keimung Proteine, Schwierigkeiten in ihrer mikroskopischen Analysen mittels Epifluoreszenz Mikroskopie. Höchstauflösung dimensional Structured Illumination Microscopy (3D-SIM) ist ein viel versprechendes Instrument, diese Hürde zu überwinden und die molekularen Details den Prozess der Keimung der Sporen von Bacillus Subtilis (B. Subtilis) zeigen. Hier beschreiben wir die Verwendung einer modifizierten SIMcheck (ImageJ)-Assistent 3D imaging-Prozess und fluoreszierende Reporter Proteine für SIM-Mikroskopie von B. Subtilis Sporen Germinosomes, Transaktionskonflikten der Keimung Proteine. Außerdem präsentieren wir ein (standard) 3D-SIM bildgebendes Verfahren für FM4-64 Färbung von B. Subtilis Sporen Membranen. Mithilfe dieser Verfahren wir unübertroffene Auflösung für die Lokalisierung der Germinosome erhalten und zeigen, dass > 80 % der B. Subtilis KGB80 Sporen nach der Sporenbildung auf definierten minimalen MOPS Medium erhalten haben, ein oder zwei GerD-GFP und GerKB-mCherry Brennpunkte. Helle Herde waren auch bei FM4-64 gefärbten Sporen 3D-SIM Bilder darauf hindeutet, dass innere Membran Lipid Domänen wahrscheinlich unterschiedliche Flüssigkeit vorhanden sein. Sind weitere Studien, mit denen doppelte Kennzeichnung Verfahren mit Membran Farbstoffe und Germinosome Reporter Proteine Co Lokalisierung zu bewerten und erhalten so einen optimalen Überblick über die Organisation des Bacillus Keimung Proteine in der inneren Spore-Membran möglich.
Introduction
Sporen der Aufträge Bacillales und Clostridiales sind metabolisch ruhenden und außerordentlich widerstandsfähig gegen raue Dekontamination Regime, aber es sei denn, sie Keimen, können nicht dazu führen, dass schädliche Auswirkungen im Menschen1. In nährstoffreichen germinant ausgelöste Keimung der Sporen von Bacillus Subtilis (B. Subtilis) ist die Einleitung Veranstaltung germinant Bindung an germinant Rezeptoren (GRs) befindet sich in der Spore innere Membran (IM). Anschließend transduzieren die GRs Signale an den SpoVA-Kanal-Protein befindet sich auch in der IM. Dies führt bei der Entstehung des Austauschs von Spore Kern Pyridin-2,6-dicarboxylic Säure (Dipicolinic Säure; DPA; bestehend aus 20 % der Spore Kern trocken wt) für Wasser über den SpoVA Kanal. Anschließend die DSG-Version löst die Aktivierung der Hirnrinde Peptidoglycan Hydrolyse und zusätzliche Wasseraufnahme folgt2,3,4. Diese Ereignisse führen zu mechanischen Belastungen auf die Schichten, seine spätere Ruptur, Beginn der Auswuchs und schließlich vegetative Wachstum. Die genauen molekularen Details der Keimungsprozess werden jedoch noch weit von aufgelöst.
Eine wichtige Frage zu Spore Keimung betrifft die biophysikalischen Eigenschaften der Lipide IM Keimung Proteine sowie die IM SpoVA-Kanal-Proteine. Diese weitgehend unbeweglich IM Lipid Bilayer ist die wichtigste Permeabilitätsbarriere für viele kleine Moleküle, einschließlich giftige chemische Konservierungsmittel, von die einige ihr Handeln in die Spore Kern oder vegetativen Zelle Zytoplasma5,6ausüben. IM Lipid Bilayer dürfte in einem Gel-Zustand gibt es zwar ein erheblicher Anteil der mobilen Lipide in der IM5. Die Spore IM hat auch das Potenzial für signifikante Erweiterung5. Somit erhöht sich die Fläche der IM 1,6-fache bei der Keimung ohne zusätzliche Membran Synthese und geht einher mit dem Verlust dieser Membran charakteristische niedrige Permeabilität und Lipid Unbeweglichkeit5,6.
Während die molekularen Details der Aktivierung von Proteinen, Keimung und Organisation IM Lipide in Sporen sind attraktive Themen für das Studium, Herausforderung die geringe Größe von B. Subtilis Sporen und die relativ geringen Fülle der Keimung Proteine, eine mikroskopische Analysen. Griffiths Et Al. zwingende Beweise dafür Epifluoreszenz Mikroskop, mit fluoreszierenden Reporter verschmolzen zu Keimung Proteine, legt nahe, dass das Gerüst Protein GerD B. Subtilis Sporen drei GR-Untereinheiten (A, B und C) für GerA, B und K GRs organisiert, in einer Cluster-7. Sie prägte den Begriff “Germinosome” für diesen Cluster der Keimung Proteine und die Strukturen als ~ 300 nm großen IM Protein Brennpunkte8beschrieben. Bei der Initiation der Spore Keimung, fluoreszierende Germinosome Brennpunkte letztlich verwandeln sich in größeren disperse fluoreszierende Muster mit > 75 % der Spore Bevölkerungen Anzeigen dieses Muster in Sporen gekeimt für 1 h mit L-Valin-8. Beachten Sie, dass das Papier oben verwendeten genannten Bilder aus Dutzenden von aufeinander folgenden fluoreszierenden Bilder gemittelt, um statistische Aussagekraft gewinnen und die Hürde niedrig fluoreszierende Signale beobachtet während der Bildgebung. Diese Visualisierung dieser Strukturen in Bakteriensporen war am Rande des technisch mit klassischen mikroskopischen Tools und weder eine Bewertung der Höhe der Herde in einem einzigen Spore Machbaren auch ihre ausführlichere subzelluläre Lokalisation mit diesem Ansatz möglich.
Hier zeigen wir den Einsatz von strukturierten Beleuchtung Mikroskopie (SIM), eine detaillierte Visualisierung zu erhalten und Quantifizierung der Germinosome(s) in Sporen von B. Subtilissowie ihre IM Lipid Domänen9. Das Protokoll enthält auch Anleitungen für die Sporenbildung, Folie Vorbereitung und Bildanalyse von SIMcheck (v1. 0, eine ImageJ-Plugin) sowie ImageJ10,11,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Protokoll präsentiert enthält ein standard-3D-SIM-Verfahren zur Analyse von FM4-64 gebeizt B. Subtilis Sporen, die Sporenbildung, Folie Vorbereitung und bildgebende Verfahren enthält. Darüber hinaus beschreibt das Protokoll eine modifizierte SIMcheck (ImageJ)-unterstützt 3D imaging-Prozess für die SIM-Mikroskopie von B. Subtilis Spore Germinosomes beschriftet mit fluoreszierenden Reportern. Die letztere Vorgehensweise konnten wir diese dim Unterkonstruktion mit verbesserten Kontrast zu beobach…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Christiaan Zeelenberg für seine Unterstützung während der SIM-Bildgebung. JW anerkennt der China Scholarship Council für ein Promotionsstipendium und Dank Irene Stellingwerf für ihre Hilfe in der primären Phase der Bildgebung.
Materials
| Air dried glass slides | Menzel Gläser | 630-2870 | |
| APO TIRF N20R8 100× oil objective (NA=1.49) | |||
| B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan) | |||
| B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) | |||
| Erlenmeyer flasks 1 L | Sigma-Aldrich | Z567868 | |
| Erlenmeyer flasks 250 mL | Sigma-Aldrich | Z723088 | |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres | Invitrogen, 0.1 μm | F8803 | |
| FM4-64 | Thermo Fisher Scientific | F34653 | |
| Histodenz nonionic density gradient medium | Sigma-Aldrich | D2158 | |
| Image J | |||
| iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera | Andor Technology | https://imagej.net/Welcome | |
| LB Agar | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| Microfuge tubes 1.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 3451PK | |
| Microscope imaging software | Nikon, Japan | NIS-Element AR 4.51.01 | |
| MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water | Millipore | Milli-Q IQ 7003 | |
| Nikon Eclipse Ti microscope | |||
| Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL | Thermo Fisher Scientific | 75003800 | |
| Precision Coverslips | Paul Marienfeld | 117650 | |
| Round Bottom tubes 15 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM | |
| Screw cap tubes 50 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM |
Referências
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