Aqui, apresentamos um protocolo para medir KDM1A engajamento alvo em uma célula humana ou animal, tecido ou amostras de sangue tratadas com inibidores da KDM1A. O protocolo emprega a marcação do chemoprobe da enzima livre de KDM1A e a quantificação direta da ocupação do alvo usando immunoensaios quimioprobe-baseados e pode ser usada em estudos pré-clínicos e clínicos.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Medição direta do KDM1A Target Engagement usando imunoensaios baseados em Quimiosonda
Neste artigo
Resumo
Resumo
A avaliação do engajamento alvo, definida como a interação de um fármaco com a proteína para a qual foi projetada, é um requisito básico para a interpretação da atividade biológica de qualquer composto no desenvolvimento de fármacos ou em projetos de pesquisa básica. No Epigenetics, o acoplamento do alvo é avaliado o mais frequentemente pela análise de marcadores do proxy em vez de medir a União do composto ao alvo. Os leituras biológicos a jusante que foram analisados incluem a modulação da marca do histona ou as mudanças da expressão de Gene. KDM1A é uma desmetililase de lisina que remove grupos metilo de mono e H3K4 dimetilizados, uma modificação associada ao silenciamento da expressão gênica. A modulação dos marcadores do proxy é dependente do tipo e da função da pilha da make-up genética das pilhas investigadas, que pode fazer a interpretação e a comparação do Cruz-caso completamente difícil. Para contornar estes problemas, um protocolo versátil é apresentado para avaliar os efeitos da dose e a dinâmica do acoplamento direto do alvo de KDM1A. O ensaio descrito faz uso de uma quimiosonda KDM1A para capturar e quantificar a enzima desinibida, pode ser amplamente aplicada a células ou amostras de tecido sem a necessidade de modificação genética, tem uma excelente janela de detecção, e pode ser usado tanto para pesquisa básica e análise de amostras clínicas.
Introdução
O demetilase específico 1 de lysine (KDM1A)1 é um demetilase envolvido no controle da transcrição do gene. Esta proteína emergiu como um alvo farmacológico candidato2 em Oncologia; incluindo leucemia mielóide aguda3 (AML), síndrome de mielodisplasia (MDS)4, mielofibrose (MF)5,6, câncer de pulmão de pequenas células (SCLC)7; em doença falciforme (SCD)8,9, e em doenças do sistema nervoso central, incluindo a doença de Alzheimer (AD), es....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Amostras de sangue foram obtidas do Instituto de Investigación biomédica Sant Pau biobank de acordo com a legislação espanhola (Real Decreto de biobancos 1716/2011) e aprovação dos comitês de ética locais. Estudos com tecidos animais foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais para o cuidado e uso de animais de laboratório (diretiva do Conselho das Comunidades Europeias 86/609/CEE), instituído pelo Comitê de ética para experimentação animal no PRAAL-PCB.
1. preparação de amostras biológicas para o ensaio.
PRECAUÇÃO: Este protocolo envolve a manipulação de amostras biológicas que podem ser s....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
A linearidade da determinação KDM1A total e livre.
Uma série padrão foi preparada conforme descrito na etapa 5.3.2., usando 0 a 2500 PG de enzima recombinante humana KDM1A de comprimento total. Os valores de RLU de rKDM1A total e livre foram avaliados para verificar a linearidade (Figura 2a e 2B). Os dados são representados como média a partir de 3 experimentos com .......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
O protocolo apresentado aqui foi desenvolvido para medir diretamente o engajamento alvo de KDM1A usando um romance KDM1A com base na captura de quimiosonda ELISA. O método foi validado em linhagens de células humanas cultivadas e amostras ex vivo de humano, rato e rato e babuíno (incluindo PBMCs, pulmão, cérebro, pele, tumores), mas pode ser prontamente aplicada a outras espécies em que o anticorpo KDM1A resumos alvo e catalítico Centro são conservadas. Como OG-881 é um quimioprobe baseado na atividade, a qualidade da am.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
A autora Tamara Maes é diretora executiva e acionista, e os autores Cristina Mascaró e Raquel Ruiz Rodriguez são funcionários da ORYZON Genomics S.A. ORYZON Genomics S.A. desenvolve inibidores da KDM1A e detém patentes abrangendo compostos e métodos utilizados Neste artigo.
Agradecimentos
Este estudo foi financiado pela ORYZON Genomics. S.A., Hoffman-la Roche, e parcialmente apoiada pelo programa de colaboração CIIP-20152001 e RETOS RTC-2015-3332-1.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,05% Tripsina-EDTA (1X) | Thermo Scientific | #25300-062 | |
| 10 X Comprimidos Inibidores de Protease | Roche | #11836153001 | |
| 96 bloco de armazenamento de poços profundos | VWR | #734-1679 | |
| 96 placas ELISA de 96 poços Adesivo | Nunc | #436110 | |
| Filme preto adesivo | Perkin Elmer | #6050173 | |
| Adesivo película transparente | VWR | #60941-062 | |
| Sonda KDM1A biotinilada OG-881 | Oryzon Genomics S.A. | Albumina | |
| Sigma | # 3117057001 | ||
| Albumina de soro bovino Standard | Thermo Scientific | #23208)Ensaio | |
| proteína de Bradford | BioRad | #500-0001 | |
| Tampão de lise celular 10X | Cell Signaling | #9803 | |
| Centrífuga para placas de 96 poços | Hettich | Rotina 420R | |
| Frasco | Thermo Scientific | #156499 | |
| Comprimento total, enzimaticamente ativo humano Recombinante LSD1 / KDM1A | Active Motif | #31426 | |
| Graphpad Prism 5 Project | GraphPad Software | NA | |
| Luminol-Enhacer e Solução de Peróxido (Substrato Quimioluminescente) | Thermo Scientific | #37074 | |
| Micro Centrífuga | Eppendorf | 5415 R | |
| Leitor de microplacas Infinite 200-Tecan | Tecan | Infinite 200 | |
| Anticorpo de captura monoclonal de camundongo Anti-KDM1A (epítopo N-terminal) | Abcam | #ab53269 | |
| Agulha G18 gauge blunt | BD | #303129 | |
| ORY-1001 (iadademstat) | Oryzon Genomics S.A. | Tubos | |
| PBMC 10 ml | Greiner bio-one | #163288 | |
| Tubos de separação PBMC 50 ml | Greiner bio-one | #227288 | |
| PBS 1x | Sigma | #D8537 | |
| Agitador de placas | Heidolph Instruments | Rotamax 120 | |
| Polissorbato 20 | Sigma | #P7949 | |
| Anticorpo de detecção monoclonal de coelho Anti-KDM1A (epítopo C-terminal) | Sinalização celular | #672184BF-100 | |
| Anticorpo secundário Burro conjugado com peroxidase Burro Anti-coelho IgG | Thermo Scientific | #31458 | |
| Cubeta de espectrofotômetro 1.5 | Deltalab | #302100 | |
| Espectrofotômetro para cubeta | GE Healthcare | GeneQuant 1300 | |
| Estreptavidin | Promega | #Z704A | |
| Seringa | BD | #303172 | |
| Tipo 1 água ultrapura | Millipore Milli-Q | Advantage A10 | |
| Limpador ultrassónico | VWR | USC200T |
Referências
- Shi, Y. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell. 119 (7), 941-953 (2004).
- Maiques-Diaz, A., Somervaille, T. C. LSD1: biologic roles and therapeutic targeting. Epigenomics. 8 (8), 1103-1116 (2016).
- Maes, T.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
