Perfilado e identificación de nitropéptidos ilustrados por Angiotensin A II
Summary
El perfilado proteómico de las proteínas nitratodeadas por tirosina ha sido una técnica desafiante debido a la baja abundancia de la modificación de 3-nitrotirosina. Aquí describimos un enfoque novedoso para el enriquecimiento y perfilado de nitropéptidos mediante el uso de Angiotensin II como modelo. Este método se puede extender para otros sistemas in vitro o de vivo.
Abstract
La nitración proteica es una de las modificaciones post-traduccionales más importantes (PTM) en residuos de tirosina y puede ser inducida por acciones químicas de especies reactivas de oxígeno (ROS) y especies reactivas de nitrógeno (RNS) en células eucariotas. La identificación precisa de los sitios de nitración en las proteínas es crucial para comprender los procesos fisiológicos y patológicos relacionados con la nitración de proteínas, como la inflamación, el envejecimiento y el cáncer. Dado que las proteínas nitradas son de baja abundancia en células incluso en condiciones inducidas, no se han desarrollado métodos universales y eficientes para la elaboración de perfiles e identificación de sitios de nitración proteica. Aquí describimos un protocolo para el enriquecimiento de nitropéptidos mediante el uso de una reacción de reducción química y etiquetado de biotina, seguido de espectrometría de masas de alta resolución. En nuestro método, los derivados de nitropéptidos se pueden identificar con alta precisión. Nuestro método exhibe dos ventajas en comparación con los métodos reportados anteriormente. En primer lugar, el etiquetado de dimetil se utiliza para bloquear la amina primaria en nitropéptidos, que se puede utilizar para generar resultados cuantitativos. En segundo lugar, se utiliza un enlace de disulfuro que contiene reactivo de biotina NHS para el enriquecimiento, que se puede reducir y alquilar aún más para mejorar la señal de detección en un espectrómetro de masas. Este protocolo se ha aplicado con éxito al péptido modelo Angiotensin II en el documento actual.
Introduction
La nitración de residuos de tirosina en proteínas para formar 3-nitrotirosina regula muchos procesos biológicos. Debido a las diferentes propiedades químicas entre tirosina y 3-nitrotirosina, una proteína nitrada puede haber perturbado la actividad de señalización1,2. Por lo tanto, es importante desarrollar métodos que puedan enriquecer e identificar los sitios de nitración en las proteínas de manera eficiente. Como la 3-nitrotirosina es una modificación de baja abundancia en las proteínas en comparación con otras formas de PTM, como la fosforilación y la acetilación, es difícil identificar los sitios de nitración endógenas directamente a partir de líneas celulares o muestras de tejido. Sin embargo, se ha desarrollado la metodología de uso de espectrometría de masas (Em) para caracterizar el patrón de fragmentación del nitrotpéptido (por ejemplo, Zhan & Desiderio3), que sienta las bases para nuevos métodos de nitroproteómica.
Actualmente, un paso de enriquecimiento seguido por la EMes la estrategia más poderosa para el perfilado de nitropéptidos 4,5. Los métodos de enriquecimiento se pueden clasificar en dos clases. Una clase se basa en anticuerpos que pueden reconocer 3-nitrotirosina específicamente, mientras que la otra clase se basa en la derivación química que reduce un grupo de nitro a un grupo de aminas4,5. Para el método basado en anticuerpos, la columna de afinidad de nitrotyrosina se utiliza para el enriquecimiento, a partir del cual el material eludado se resuelve y analiza más adelante por la alta resolución MS6,7. Para el método basado en derivación química, los grupos de amina en el N-terminus del péptido o lisina deben ser bloqueados en el primer paso ya sea por acetilación, etiquetas isobáricas para la cuantificación relativa y absoluta (iTRAQ), o reactivos de etiquetas de masa en tándem (TMT). A continuación, se utiliza un reductor para reducir la nitrotirosina a la aminotyrosina seguido de la modificación del grupo de aminas recién formado, que incluye ligadura de biotina, conversión de péptido sulfícula u otros tipos de sistemas de etiquetado8,9, 10,11. La mayoría de los protocolos establecidos hasta ahora se basan en proteínas con sobrenitrato de vitro, en lugar de proteínas nitratos endógenas.
En el presente estudio, se desarrolla un procedimiento modificado de derivación química de nitrotirosina para el enriquecimiento e identificación de nitropéptidos, que muestra una mayor sensibilidad durante la detección de LA MS y es adecuado para fines de cuantificación. Nuestro estudio reciente que emplea este método en sistemas biológicos identificó que la nitración de la tetirosina quinasa de proteína específica de linfocitos (LCK) en Tyr394 por RNS producido a partir de células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) juega un papel importante en el inmunosupresión del microambiente tumoral12. Por lo tanto, nuestro método de identificación de nitropéptidos también se puede aplicar a muestras biológicas complejas. Aquí, describimos nuestro protocolo utilizando el péptido modelo Angiotensin II, del cual el patrón de fragmentación es conocido y ampliamente utilizado en estudios nitroproteómicos8,9,10,11, como ejemplo.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo aquí describe el enriquecimiento y perfilado de nitropéptidos. Utilizando Angiotensin II como péptido modelo, ilustramos el procedimiento que se muestra en la Figura1. Después de obtener la nitro-angiotensina II, la amina primaria en el péptido debe bloquearse para evitar la conjugación de amina adicional, que es uno de los pasos más críticos dentro del protocolo. En el protocolo actual, el etiquetado de dimetil según se utiliza para bloquear las aminas primarias por do…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la American Cancer Society Institutional Research Grant IRG-14-195-01 (M. Sharon Stack es Investigador Principal; X.L. es un investigador subreceptor). Esta publicación fue posible gracias al apoyo parcial de Grant Numbers KL2 TR002530 y UL1 TR002529 (A. Shekhar, PI) de los Institutos Nacionales de Salud, National Center for Advancing Translational Sciences, Clinical and Translational Sciences Award. X. L. es galardonado con el Premio Indiana CTSI KL2 Young Investigator Award. S. F. cuenta con el apoyo de las subvenciones Walther Cancer Foundation Advancing Basic Cancer. X. W. cuenta con el apoyo del Programa General de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Grant No. 817773047).
Materials
| Acclaim pepmap 100 C18 column | Thermo-Fisher | 164534 | |
| 1 M TEAB solution | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| 50% hydroxylamine | Thermo-Fisher | 90115 | |
| Acetonitrile | Thermo-Fisher | A955 | MS Grade |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Molecular Biology Grade |
| formaldehyde-D2 | Toronto Research Chemicals | F691353 | |
| formic acid | Sigma-Aldrich | 695076 | ACS reagent |
| Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo | ||
| isoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A456 | MS Grade |
| NHS-S-S-bition | Thermo-Fisher | 21441 | |
| Oasis HLB column (10 mg) | Waters | 186000383 | |
| peroxynitrite | Merck-Millipore | 516620 | |
| sodium cyanoborohydrite | Sigma-Aldrich | 42077 | PhamaGrade |
| sodium dithionate | Sigma-Aldrich | 157953 | Technical Grade |
| Streptavidin Sepharose | GE Healcare | GE17-5113-01 | |
| Ultimate 3000 nanoLC | Thermo |
Referências
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